何忠開，鄭玉菡，姚峰，鄭重洲，陳燦，李波

急性心肌梗死（AMI）是常見的心血管疾病，具有發(fā)病率高和致死率高的特點[1]。近年來，隨著飲食結構和生活方式的改變，AMI的發(fā)病率逐年攀升，嚴重威脅患者身體健康和生命安全。目前，臨床治療AMI以手術和藥物輔助治療為主，介入術和溶栓治療在治療AMI方面取得一定的療效，但是介入術后再狹窄現象表明，介入術和溶栓藥物不能從根本上抑制AMI的發(fā)病。因此，采取安全、高效的藥物治療AMI是醫(yī)學工作者研究的熱點問題。AMI的主要病理表現為心肌細胞氧化損傷和炎癥反應，重則引起心肌細胞凋亡，進而引發(fā)心力衰竭[2,3]。白藜蘆醇（Res）是一種重要的植物抗毒素，具有抗腫瘤、抗氧化、抗自由基、抗菌消炎的作用[4]。早期研究表明，Res能改善AMI大鼠心肌重構及減少心律失常[5,6]。然而，Res對AMI大鼠心肌保護作用的具體作用機制尚未完全明確，本文通過實驗驗證Res對AMI大鼠的心肌保護作用，以及對Akt/JNK3/caspase-3信號通路的影響，初步探討其發(fā)揮作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及飼料SPF級雄性SD大鼠60只，8～10周齡，體重200±20 g，購自廣東醫(yī)科大學實驗動物中心[許可證號：SCXK（粵）2016-0002]。

1.1.2 主要材料與儀器Res（生產批號：111535-201703）和法舒地爾（生產批號：100614-201603）均購自中國藥品生物制品鑒定所；兔抗鼠p-Akt、p-JNK3、caspase-3多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；3K15超低溫離心機購自德國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 AMI模型建立及鑒定根據文獻資料制備AMI模型[7]。術前將大鼠稱重，按50 mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉將大鼠麻醉，將大鼠進行消毒、剪毛，行氣管插管并連接小動物呼吸機輔助呼吸；于大鼠第3、4肋骨間剪開皮膚、肌肉及筋膜，打開大鼠胸腔，暴露心臟，在體視顯微鏡下用4號線結扎前降支，假手術組（10只）只穿線不結扎，手術結束后縫合大鼠胸腔及皮膚。造模24 h后，檢測假手術組和模型組的心電圖。

1.2.2 動物分組及給藥處理將AMI模型大鼠隨機分成5組，每組10只，分別命名為模型組、法舒地爾組、Res低劑量組、Res中劑量組、Res高劑量組。法舒地爾組：在模型組的基礎上，給予30 mg/kg法舒地爾[7]； Res低、中、高劑量組：在模型組的基礎上，分別給予10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg Res[8]。所有大鼠均行灌胃治療，1/d，持續(xù)治療2周，假手術組及模型組給予等容積生理鹽水。

1.2.3 Res對大鼠血清中各項生化指標的觀察采集各組大鼠腹主動脈血，離心后收集血清。用ELISA試劑盒檢測血清中SOD、CK、CK-MB、TnI、MDA的活性，并檢測血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.4 TTC染色檢測心肌梗死面積將大鼠麻醉后，進行剪毛和消毒處理，于無菌超凈臺內打開大鼠胸腔，用10%的甲醛溶液經主動脈灌注心臟，固定30 min左右，摘除心臟，置于預冷的PBS溶液中，每組取3只大鼠心臟去除右心房和右心室，用吸水紙吸干剩余組織表面的水分，置于-20℃存放20 min，然后由心尖部向心底部制作連續(xù)切片（厚度2 mm），將切片置于37℃孵育，1%的TTC溶液染色20 min，存活心肌組織染成紅色，梗死心肌組織染成灰白色。染色結束后用自來水沖去浮色，吸水紙吸走多余的水分，用Image master圖像分析儀分析心肌梗死面積百分比。

1.2.5 HE染色檢測Res對大鼠心臟組織病理學變化的影響每組取3只大鼠心臟組織，制作石蠟切片（厚度5 μm），脫蠟后蘇木精染色10 min，用自來水洗滌直至不再有紅色液體流下，用1%的鹽酸酒精溶液分化1 min，自來水洗滌1 min，再用伊紅染色3 min左右，自來水洗滌1 min，將組織切片逐級脫水后，二甲苯透明，中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察Res對大鼠心臟組織病理學變化的影響。

1.2.6 TUNEL檢測Res對大鼠心臟組織中心肌細胞凋亡的影響每組取3只大鼠心臟組織，制作石蠟切片（厚度5 μm），60℃烤片3 h，脫蠟后進行抗原修復，然后將玻片浸入0.1 M TBS溶液放置30 min，用PBS溶液沖洗后，然后滴加50 μl TUNEL反應液，置于濕盒中37℃孵育1 h，用PBS溶液沖洗后，滴加3%的雙氧水10 min，用PBS溶液沖洗后，滴加50 μl Converter-POD，置于濕盒中37℃孵育1 h，DBA顯色后用蘇木素復染，將組織切片逐級脫水后，二甲苯透明，中性樹膠封片，在顯微鏡下計算出細胞凋亡指數。凋亡指數=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.2.7 Res對大鼠心臟組織中p-Akt、p-JNK3、caspase-3表達水平的影響每組取4只大鼠心臟組織，加入細胞裂解液提取總蛋白，用bradford法蛋白定量試劑盒操作說明進行蛋白質含量測定，上樣量體積含50 μg蛋白，隨后進行SDSPAGE5%積層膠和12%分離膠電泳2.5 h（濃縮膠80 V進入分離膠后調至120 V）。電泳結束后，半干轉膜儀轉膜50 min，并置于含5%脫脂奶粉的封閉液中，室溫下?lián)u床封閉2 h后滴加p-Akt、p-JNK3、caspase-3一抗，置于4℃下過夜，復溫后滴加二抗，置于37℃條件下放置1 h。顯影后采集圖片，以GAPDH為內參，采用Gel-Pro analyzer4 軟件分析心臟組織中p-Akt、p-JNK3、caspase-3的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析利用統(tǒng)計學軟件SPSS 20.0進行統(tǒng)計學分析，計量資料用均數±標準差（x ±s）表示，多組采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 AMI大鼠模型鑒定與假手術組相比較，模型組大鼠心電圖ST段明顯抬高，提示AMI模型構建成功（圖1）。

圖1 假手術組和模型組大鼠心電圖情況

表1 Res對大鼠血清中SOD、CK-MB、CK、MDA、TnI活性的影響（x ±s，n=10）

2.2 Res對大鼠血清中SOD、CK、CK-MB、TnI、MDA活性的影響與假手術組相比，模型組大鼠血清中SOD的活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型組大鼠血清中CK、CK-MB、TnI、MDA的活性顯著高于假手術組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，法舒地爾組和Res組大鼠血清中SOD的活性顯著高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；法舒地爾組和Res組大鼠血清中CK、CK-MB、TnI、MDA的活性顯著低于模型組（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學意義。與法舒地爾組相比，Res低、中劑量組大鼠血清中SOD的活性顯著低于法舒地爾組（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學意義；Res低、中劑量組大鼠血清中CK、CK-MB、TnI、MDA的活性顯著高于法舒地爾組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Res高劑量組大鼠血清中CK、CK-MB、TnI、SOD、MDA的活性與法舒地爾組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

2.3 Res對大鼠血清中炎癥因子的影響與假手術組相比，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量顯著增高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，法舒地爾組和Res組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量顯著低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與法舒地爾組相比，Res低、中劑量組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量顯著高于法舒地爾組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），Res高劑量組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量與法舒地爾組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表2）。

2.4 TTC染色檢測心肌梗死面積與假手術組相比，模型組大鼠表現出明顯心肌梗死；與模型組相比，法舒地爾組和Res組大鼠心肌梗死面積顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與法舒地爾組相比，Res低、中劑量組大鼠心肌梗死面積顯著高于法舒地爾組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），Res高劑量組大鼠心肌梗死面積與法舒地爾組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖2，表3）。

2.5 HE染色檢測Res對大鼠心臟組織病理學變化的影響HE染色結果顯示假手術組心肌細胞結構分明，心肌細胞排列整齊，細胞形態(tài)未見明顯異常；模型組大鼠心肌細胞排列紊亂，且細胞著色不均，心肌纖維腫脹、斷裂；與模型組相比，法舒地爾組和Res組心肌細胞和肌纖維排列相對整齊，且隨Res劑量增加，心肌細胞內水腫和炎性細胞浸潤情況明顯減輕（圖3）。

表2 Res對大鼠血清中炎癥因子含量的影響（x ±s，n=10）

圖2 TTC染色檢測心肌梗死面積

表3 各組大鼠心肌梗死面積比較（x ±s，n=3）

圖3 HE染色檢測大鼠心臟組織病理學變化（×400）

圖4 TUNEL檢測Res對大鼠心臟組織中心肌細胞凋亡的影響（×400）

表4 TUNEL檢測Res對大鼠心臟組織中心肌細胞凋亡的影響（x±s，n=3）

2.6 TUNEL檢測Res對大鼠心臟組織中心肌細胞凋亡指數的影響與假手術組相比，模型組大鼠心肌細胞凋亡指數顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，法舒地爾組和Res組大鼠心肌細胞凋亡指數顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與法舒地爾組相比，Res低、中劑量組大鼠心肌細胞凋亡指數顯著高于法舒地爾組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），Res高劑量組大鼠心肌細胞凋亡指數與法舒地爾組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖4、表4）。

2.7 Western blot檢測Res對大鼠心臟組織中p-Akt、p-JNK3、caspase-3表達水平的影響與假手術組相比，模型組大鼠心肌組織中p-Akt表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型組大鼠心肌組織中p-JNK3、caspase-3表達水平顯著高于假手術組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，法舒地爾組和Res組大鼠心肌組織中p-Akt表達水平顯著高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；法舒地爾組和Res組大鼠心肌組織中p-JNK3、caspase-3表達水平顯著低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與法舒地爾組相比，Res低、中劑量組大鼠心肌組織中p-Akt表達水平顯著低于法舒地爾組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Res低、中劑量組大鼠心肌組織中p-JNK3、caspase-3表達水平顯著高于法舒地爾組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Res高劑量組大鼠心肌組織中p-Akt、p-JNK3、caspase-3表達水平與法舒地爾組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖5、表5）。

圖5 Western blot檢測心臟組織中p-Akt、p-JNK3、caspase-3蛋白表達情況

表5 Res對大鼠心臟組織中p-Akt、p-JNK3、caspase-3表達水平的影響（x ±s，n=6）

3 討論

AMI是冠狀動脈閉塞后，由于心肌缺血和持續(xù)性缺氧造成的心肌細胞代謝障礙及結構損傷，它是臨床常見的疾病之一[9,10]。本研究采用結扎冠狀動脈前降支的方法構建AMI模型，結果表明，模型組大鼠心電圖ST段明顯抬高，假手術組心電圖未見明顯異常，提示AMI模型構建成功。

AMI的發(fā)生發(fā)展與氧化應激反應和炎癥損傷密切相關。研究表明，血清中SOD、CK-MB的活性以及血清中炎癥因子IL-6和TNF-α 的含量在AMI的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[11]，因此緩解AMI的關鍵環(huán)節(jié)是抑制氧化應激和炎癥反應[12]。AMI中醫(yī)屬于“真心痛”、“胸痹”的范疇，因此，中醫(yī)治療AMI以益氣養(yǎng)血，正虛補陽為主[13]。Res是從葡萄以及葡萄制品中提取的植物抗毒素，具有治療心血管、抗腫瘤、抗氧化、抗自由基、抗菌消炎等多種藥理功能，能夠對抗機體的炎癥反應、并抑制炎癥損傷[4]。有研究表明，法舒地爾通過下調AMI大鼠心肌組織中炎癥因子的表達，進而抑制心肌細胞凋亡，并抑制心肌梗死[14]。因此本研究以法舒地爾為陽性藥物，探究Res對AMI大鼠心肌的保護作用。

IL-1β、IL-6和TNF-α是組織炎癥反應的標志物，參與機體的炎癥反應，在病理狀態(tài)下加重組織細胞損傷。CK在人體組織中廣泛存在，在維持細胞內三磷酸腺苷濃度中起重要作用，CK-MB是CK同工酶之一，主要存在于人體心肌中，另外肌鈣蛋白是心肌損傷指標中敏感性及特異性最高的標志物。本研究結果表明，與模型組相比，法舒地爾組和Res組心肌細胞和肌纖維排列相對整齊，且炎性細胞浸潤情況減輕；法舒地爾組和Res組SOD的活性顯著高于模型組（P＜0.05），血清中CK、CK-MB、TnI、MDA的活性及IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量顯著低于模型組（P＜0.05）；法舒地爾組和Res組心肌梗死面積和細胞凋亡指數顯著低于模型組（P＜0.05）；Res高劑量組血清中CK、CKMB、TnI、MDA的活性，血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量，以及心肌梗死面積和細胞凋亡指數，與法舒地爾組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。HE染色結果顯示假手術組心肌細胞結構分明，心肌細胞排列整齊，細胞形態(tài)未見明顯異常；模型組大鼠心肌細胞排列紊亂，且細胞著色不均，心肌纖維腫脹、斷裂；與模型組相比，法舒地爾組和Res組心肌細胞和肌纖維排列相對整齊，且隨Res劑量增加，心肌細胞內水腫和炎性細胞浸潤情況明顯減輕。提示，Res能夠抑制AMI大鼠氧化反應、炎癥損傷以及心肌細胞凋亡，進而發(fā)揮對AMI大鼠的心肌保護作用。

Res對AMI大鼠心肌具有保護作用，但具體的作用機制尚未完全明確。絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（Akt）、c-Jun氨基末端激酶（JNK3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）是細胞凋亡通路中的關鍵蛋白[15,16]。有研究表明，Akt/JNK3/caspase-3是重要的線粒體凋亡途徑，調控Akt/JNK3/caspase-3信號通路對腦缺血/再灌注損傷大鼠具有保護作用[17,18]。然而，Res對AMI大鼠Akt/JNK3/caspase-3信號通路的影響尚未見報道。本研究表明，法舒地爾組和Res組心臟組織中p-Akt表達水平顯著高于模型組（P＜0.05），p-JNK3、caspase-3表達水平顯著低于模型組（P＜0.05）；Res高劑量組心肌組織中p-Akt、p-JNK3、caspase-3表達水平與法舒地爾組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。推測，Res是能夠調控AMI大鼠Akt/JNK3/caspase-3信號通路的活性，通過抑制細胞內線粒體凋亡發(fā)揮對心肌細胞的保護作用。

綜上所述，Res對AMI大鼠心肌具有保護作用，推測這一作用是通過調控Akt/JNK3/caspase-3信號通路抑制心肌細胞凋亡，本研究為AMI的臨床治療提供一定的理論依據。