馬琳璐，李柄輝，郭嬌，趙明娟，翁鴻，劉新?tīng)N

我國(guó)心血管疾病現(xiàn)患人數(shù)高達(dá)2.9億，死亡率占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，占居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上[1]，而其中冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。–AD），高發(fā)病率和致死率，已嚴(yán)重威脅人類健康[2]。隨著基因探測(cè)技術(shù)的發(fā)展，CAD認(rèn)為是一組復(fù)雜的、多基因與環(huán)境相互作用的疾病[3-5]。研究表明多種基因突變可以增加CAD風(fēng)險(xiǎn)，其中以一氧化氮合酶家族表皮型一氧化氮合酶基因（eNOS）關(guān)系最密切[6,7]。

當(dāng)eNOS基因位點(diǎn)發(fā)生突變，如eNOS基因啟動(dòng)子區(qū)T786-C位點(diǎn)，胸腺嘧啶(T)被等位基因胞嘧啶(C)所取代；4號(hào)內(nèi)含子處的27個(gè)堿基發(fā)生5次重復(fù)（記錄為4b），少數(shù)變異發(fā)生4次重復(fù)（記錄為4a），會(huì)導(dǎo)致eNOS蛋白結(jié)構(gòu)、生物活性改變，引起血液中NO濃度的改變，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，進(jìn)而誘發(fā)CAD。目前，已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，T786-C和4b/a多態(tài)性與CAD的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[8,9]。然而Ragia等[10]研究表明eNOST786-C與CAD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)并無(wú)關(guān)聯(lián)，Sigusch等[11]指出在德國(guó)人群中并未發(fā)現(xiàn)4b/a多態(tài)性與CAD的關(guān)系。由于不同國(guó)家地區(qū)人群基因頻率的差異，國(guó)人eNOS基因T786C和4b/a位點(diǎn)多態(tài)性與CAD的風(fēng)險(xiǎn)尚未得到全面地評(píng)價(jià)。因此，本研究擬采用Meta分析的方法，遵照PRISMA報(bào)告規(guī)范[12]，對(duì)國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的關(guān)于eNOS基因T786C和4b/a多態(tài)性與中國(guó)人群CAD發(fā)病相關(guān)性進(jìn)行研究，以期得出較為客觀的結(jié)論。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)納入排除標(biāo)準(zhǔn)所納入的研究符合以下標(biāo)準(zhǔn)：①主題為研究eNOS基因T786-C和/或4b/a位點(diǎn)多態(tài)性與中國(guó)人群冠心病相關(guān)性，冠心病有明確的診斷標(biāo)準(zhǔn)（冠狀動(dòng)脈造影示：至少一支冠狀動(dòng)脈血管狹窄≥50%；或符合WHO缺血型冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)）；②直接報(bào)道了或者報(bào)道的數(shù)據(jù)能夠估算出優(yōu)勢(shì)比（OR）及其95%可信區(qū)間（CI）；③研究設(shè)計(jì)為病例-對(duì)照研究；④重復(fù)發(fā)表或數(shù)據(jù)相同的研究，按照Little等[13]推薦的方法選擇方法學(xué)質(zhì)量更高、數(shù)據(jù)更全的研究。文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn)：①非中、英文文獻(xiàn)；②對(duì)照組為非健康對(duì)照者。

1.2 文獻(xiàn)檢索由兩名作者獨(dú)立檢索公開(kāi)發(fā)表的研究，并交叉核對(duì)，遇有爭(zhēng)議則第3位作者介入并通過(guò)討論達(dá)成一致。以檢索式(“endothelial nitric oxide synthase” OR “eNOS”O(jiān)R “NOS3”O(jiān)R“ECNOS”) AND (“polymorphism” OR“genetic”O(jiān)R “mutation” OR “variant”) AND(“coronary atherosclerotic heart disease”O(jiān)R“coronary heart disease” OR “coronary artery disease” OR“myocardial infarction”)計(jì)算機(jī)檢索PubMed、Embase，以中文主題詞“冠心病、心肌梗塞、心肌梗死、內(nèi)皮型一氧化氮合酶”檢索CNKI、萬(wàn)方和VIP數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索時(shí)間均為建庫(kù)至2017年10月10日（更新檢索于2017年11月13日）。同時(shí)，手檢納入研究的參考文獻(xiàn)，以防漏檢。

1.3 資料提取資料提取由兩名作者獨(dú)立進(jìn)行資料，內(nèi)容包括第一作者的姓名和發(fā)表年代，研究的地點(diǎn)，種族和基因分布位點(diǎn)，校正OR值及95%CI，校正因素等。提取完畢后交叉核對(duì)，并通過(guò)討論解決分歧。

1.4 質(zhì)量評(píng)價(jià)方法學(xué)質(zhì)量評(píng)價(jià)采用專用于病例-對(duì)照研究的紐卡斯?fàn)?渥太華量表（Newcastle -Ottawa Scale，NOS）[14]，包括研究人群的選擇、組間可比性和暴露因素的測(cè)量3個(gè)方面共8個(gè)條目，組間可比性為2分，其余均為1分，共9分。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析采用RevMan 5.3軟件對(duì)基因模型進(jìn)行Meta分析。用卡方檢驗(yàn)對(duì)照組基因型是否符合哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE）。采用I2和Q檢驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)異質(zhì)性，若研究間同質(zhì)性好（P＞0.1且I2＜50%）選擇固定效應(yīng)模型，反之更換為隨機(jī)效應(yīng)模型。并根據(jù)可能導(dǎo)致異質(zhì)性的原因（種族，是否滿足HWE平衡[15]等）進(jìn)行亞組分析。排除對(duì)照組不符合HWE的研究進(jìn)行敏感性分析，驗(yàn)證結(jié)果的穩(wěn)定性。效應(yīng)量采用OR及其95%CI描述，以α=0.05為Meta分析的檢驗(yàn)水準(zhǔn)，對(duì)于校正后的數(shù)據(jù)，根據(jù)所報(bào)告的遺傳模型直接合并相關(guān)的ORs和95%的CIs。用漏斗圖檢測(cè)是否存在發(fā)表偏倚。本研究分析的模型包括：等位基因模型、純合子模型、雜合子模型、顯性模型和隱性模型。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果初檢文獻(xiàn)1147篇，經(jīng)篩選最終納入14篇文獻(xiàn)共18個(gè)病例-對(duì)照研究[16-28]，共計(jì)4585例CAD患者，4555例健康對(duì)照人群。文獻(xiàn)篩選流程圖見(jiàn)圖1。

2.2 納入研究一般特征18個(gè)病例-對(duì)照研究的診斷標(biāo)準(zhǔn)明確，組間可比性好，基因檢測(cè)方法合理，結(jié)果數(shù)據(jù)明確。依照NOS，納入研究的質(zhì)量均較高，為7～9分。納入研究的一般情況及質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 Meta分析結(jié)果

圖1 文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果

表1 納入研究的基本特征

2.3.1 eNOS T786-C總體人群的Meta分析結(jié)果顯示，C等位基因人群CAD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高于T等位基因人群（OR=1.67，95%CI：1.45～1.92），CC基因型人群CAD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高于TT基因型人群（OR=2.35，95%CI：1.43～3.85）；TC基因型人群CAD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高于TT基因型人群（OR=1.68，95%CI：1.44～1.97）；CC+TC基因型人群CAD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高于TT基因型人群（OR=1.73，95%CI：1.49～2.02）；CC基因型人群CAD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高于TC+TT基因型人群（OR=2.02，95%CI：1.23～3.30）（表3）。

2.3.2 eNOS 4b/a總體人群的Meta分析結(jié)果顯示，a等位基因人群CAD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高于b等位基因人群（OR=1.54，95%CI：1.34～1.77）；aa基因型人群CAD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高于bb基因人群（OR=3.55，95%CI：2.15～5.86）；ab基因型人群CAD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高于bb基因人群（OR=1.32，95%CI：1.12～1.55）；aa+ab基因型人群CAD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高于bb基因人群（OR=1.48，95%CI：1.27～1.72）；aa基因型人群CAD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高于ab+bb基因人群（OR=3.32，95%CI：2.01～5.49）（表4）。

表2 已校正混雜因素的研究信息與結(jié)果

表3 eNOS T786-C總體Meta分析及亞組分析結(jié)果

2.4 亞組分析及敏感性分析結(jié)果在eNOS T786-C多態(tài)性與國(guó)人CAD風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性研究中，校正OR值亞組分析，與整體人群結(jié)果相似；在eNOS4b/a多態(tài)性與國(guó)人CAD風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性研究中，基于種族、校正OR值的亞組分析中，該位點(diǎn)多樣性均可增加國(guó)人CAD風(fēng)險(xiǎn)，但在校正OR值研究中，異質(zhì)性較整體人群變大，可能為人群基因多態(tài)性與吸煙、高血壓、血糖等因素?zé)o必要關(guān)聯(lián)?；谂懦龑?duì)照組不符合HWE的研究進(jìn)行敏感性分析的結(jié)果，兩組研究均與總體人群結(jié)果相近，提示結(jié)果穩(wěn)健性較好（表2～4）。

2.5 發(fā)表偏倚采用漏斗圖對(duì)4b/a多樣性與CAD風(fēng)險(xiǎn)研究進(jìn)行發(fā)表偏倚評(píng)估（圖2），漏斗圖顯示兩側(cè)不完全對(duì)稱，表明有一部分研究未發(fā)表或存在一些灰色文獻(xiàn)未檢出，該研究存在一定的發(fā)表偏倚；受納入研究數(shù)量影響（＜10篇），未對(duì)T786-C多樣性與CAD風(fēng)險(xiǎn)研究檢測(cè)，不可避免有一定的發(fā)表偏倚存在。

3 討論

本研究綜合評(píng)價(jià)了當(dāng)前關(guān)于eNOS基因T786-C和4b/a 多態(tài)性與中國(guó)人群CAD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)研究，結(jié)果表明，eNOS T786-C多態(tài)性，C等位基因人群CAD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是T等位基因的1.67倍，eNOS 4b/a多態(tài)性a等位基因人群CAD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是b基因型的1.54倍。本Meta分析共18個(gè)病例-對(duì)照研究，4585例CAD患者，4555例健康對(duì)照人群。在基因eNOST786-C多態(tài)性與中國(guó)人群CAD研究中，共納入8篇文章，全為漢族人群，結(jié)果提示，T786-C多態(tài)性增加中國(guó)人群CAD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。其中，有3篇校正吸煙、高血壓、血糖等因素后結(jié)果顯示T786-C位點(diǎn)改變與仍增加中國(guó)人群CAD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，與整體人群結(jié)果差別不大；另有1項(xiàng)研究對(duì)照組不符合HWE，敏感性分析將此研究剔除，所得結(jié)果與整體人群相似，提示本Meta分析穩(wěn)健性較好。eNOS基因4b/a 多態(tài)性與中國(guó)人群CAD研究中，共納入10篇文章，9篇漢族人群，1篇維吾爾族，結(jié)果提示，eNOS基因4b/a多態(tài)性明顯增加中國(guó)人群CAD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，尤其是維吾爾族人群，但少數(shù)民族納入的文獻(xiàn)數(shù)量少，結(jié)論需要進(jìn)一步驗(yàn)證。其中3篇校正吸煙、高血壓、血糖等因素后，顯示4b/a多樣性仍增加中國(guó)人群CAD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，與整體人群結(jié)果差別不大。

表4 eNOS 4b/a總體Meta分析及亞組分析結(jié)果

推測(cè)eNOS基因T786-C和4b/a多態(tài)性可增加中國(guó)人群CAD風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)生機(jī)制：位于eNOS啟動(dòng)子區(qū)域的T786-C其多樣性可以影響eNOS表達(dá)水平，降低eNOS mRNA和NO水平；位于內(nèi)含子區(qū)域的4b/a多樣性，可能與eNOS基因調(diào)控區(qū)域的其他功能性變異體處于連鎖不平衡狀態(tài)，從而影響NO的生物利用度和活性[29]。與Ragia等[10]和Sigusch等[11]研究不同，本研究著重于探索在中國(guó)人群中eNOST786-C和4b/a多態(tài)性與CAD風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系，且研究對(duì)象一致，在一定程度上降低了相關(guān)的臨床異質(zhì)性。

圖2 eNOS基因4b/a多樣性整體人群等位基因型a/b與CAD風(fēng)險(xiǎn)研究漏斗圖

本研究表明中國(guó)人群eNOS T786-C和4b/a多態(tài)性與CAD風(fēng)險(xiǎn)之間有顯著的關(guān)聯(lián)，但無(wú)法明確其eNOS T786-C位點(diǎn)多態(tài)性與eNOS 4b/a之間是否有交互作用，需要更多的原始研究來(lái)探索基因位點(diǎn)功能；同時(shí)本研究納入校正混雜因素的原始研究數(shù)目較少，需要設(shè)計(jì)更多嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑囼?yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，由于CAD是多基因位點(diǎn)突變共同參與所致，通過(guò)測(cè)定人群中特定基因位點(diǎn)和基因型可有效評(píng)估CAD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)臨床CAD的防治具有重要的指導(dǎo)意義。

本研究也存在一定的局限性：①本研究為Meta分析，屬于二次分析，因此本研究的質(zhì)量主要取決于納入研究的整體質(zhì)量；②納入研究的對(duì)象僅為中國(guó)人群，影響結(jié)論的外推性；③納入研究的對(duì)照組來(lái)源多數(shù)為醫(yī)院人群，可能不具有完全的代表性，因而更容易出現(xiàn)選擇偏倚；④納入的部分研究樣本量較小，檢驗(yàn)效能不足；⑤本Meta分析的研究間有中度的異質(zhì)性，可能會(huì)降低本研究結(jié)論的可信度。

綜上所述，本Meta分析的結(jié)果表明，eNOS基因T786-C和4b/a多態(tài)性皆會(huì)增加中國(guó)人群CAD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，受納入研究的數(shù)量與質(zhì)量限制，上述結(jié)論尚需更多大樣本高質(zhì)量研究予以驗(yàn)證。