饒小娟，吳毓敏，王彥

糖尿病是人類(lèi)最常見(jiàn)的慢性疾病之一，預(yù)計(jì)至2030年全球糖尿病患者數(shù)量將達(dá)4.39億，其中2型糖尿病患者超過(guò)糖尿病總?cè)藬?shù)的90%。糖尿病心血管并發(fā)癥是造成患者死亡的重要原因，占糖尿病相關(guān)死亡總?cè)藬?shù)的70%以上。糖尿病性心肌?。―CM）是糖尿病患者重要的心臟并發(fā)癥，其病理特征為心肌細(xì)胞肥大、變性、壞死以及胞外間質(zhì)膠原沉積和纖維化，為造成心力衰竭的關(guān)鍵原因[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)[3-5]，氧化應(yīng)激和自噬相互作用在DCM的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。DCM發(fā)生的主要原因?yàn)檠踝杂苫≧OS）的增多，ROS達(dá)到一定水平后即可激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號(hào)通路，導(dǎo)致下游絲氨酸的磷酸化水平增加，影響正常的胰島素信號(hào)通路，進(jìn)而引起胰島素抵抗的發(fā)生。Akt/mTOR信號(hào)通路為調(diào)控細(xì)胞自噬的重要通路。麥冬為治療糖尿病的常用中藥，而麥冬皂苷為麥冬的主要有效成分之一[6]。故本研究通過(guò)建立糖尿病大鼠模型，探究麥冬皂苷對(duì)模型大鼠心肌細(xì)胞自噬及AMPK/Akt/mTOR通路的影響，以期為麥冬皂苷的臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)8周齡雄性C57BL/6J大鼠58只，體重18～20 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑高脂飼料60% kcal%（D12492）、基礎(chǔ)飼料10% kcal%（D12450B）購(gòu)自美國(guó)Research Diets公司；麥冬皂苷（純度90%）由本室提??；羅格列酮購(gòu)自太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠(chǎng)；鏈脲佐菌素（STZ）購(gòu)自北京索萊寶生物公司；蘇木精-伊紅（HE）染色液購(gòu)自北京索萊寶公司；組織蛋白提取試劑購(gòu)自南京凱基生物公司；一抗羊抗鼠AMPK、p-AMPK、Akt、p-Akt單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；一抗兔抗鼠Beclin1、LC3-Ⅰ/Ⅱ、mTOR、p-mTOR單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abgent公司；二抗山羊抗兔IgG溶液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 動(dòng)物模型制備2型糖尿病模型建立參考梁海霞等[7]方法。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，空腹12 h后經(jīng)尾靜脈采血測(cè)定血糖，稱(chēng)體后，隨機(jī)分為對(duì)照組（8只）和2型糖尿病模型組（50只）。模型組大鼠給予高脂飲食60% kcal%，對(duì)照組大鼠給予基礎(chǔ)飲食10% kcal%，飼養(yǎng)3個(gè)月，對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)（IPGTT）和腹腔胰島素耐量實(shí)驗(yàn)（IPITT）。對(duì)糖尿病模型組中出現(xiàn)存在胰島素抵抗的大鼠，空腹6 h后，腹腔注射給予100 mg/kg新配置的STZ（用0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液溶解），STZ注射5 d后，禁食3 h，經(jīng)尾靜脈采血測(cè)定隨機(jī)血糖，血糖濃度≥250 mg/dl定義為糖尿病，納入后續(xù)研究。對(duì)照組腹腔注射給予等量檸檬酸鈉緩沖液。

1.4 分組與給藥處理對(duì)照組大鼠繼續(xù)給予對(duì)照飲食10% kcal%；糖尿病模型組隨機(jī)分為模型組、羅格列酮（陽(yáng)性藥物）組和麥冬皂苷低、中、高劑量組，每組10只。麥冬皂苷給藥劑量參考寧萌等[6]方法。陽(yáng)性藥物組灌胃給予2 mg/kg羅格列酮，麥冬皂苷低、中、高劑量組分別灌胃給予50、100、200 mg/kg麥冬皂苷，對(duì)照組和模型組灌胃給予等量生理鹽水，1/d。連續(xù)給藥6周后，將大鼠處死，剖胸取出心臟，稱(chēng)重后4 ℃預(yù)冷生理鹽水沖洗，取左心室心肌組織于正中分成兩份，一份于4%多聚甲醛溶液中固定，一份于液氮中凍存。

1.5 生化及檢查指標(biāo)IPGTT和IPITT檢測(cè)：大鼠高脂飼養(yǎng)3個(gè)月時(shí)，行IPGTT和IPITT檢測(cè)。IPGTT：大鼠禁食12 h后，腹腔注射給予1 g/kg葡萄糖，分別在注射后0、15、30、60、120 min經(jīng)尾靜脈采血測(cè)定血糖，繪制大鼠IPGTT血糖-時(shí)間曲線(xiàn)，利用SPSS 20.0軟件計(jì)算出曲線(xiàn)下面積（AUC）。IPITT：大鼠禁食4 h后，腹腔注射給予1 U/kg胰島素，分別在注射后0、15、30、60、120 min經(jīng)尾靜脈采血測(cè)定血糖，繪制大鼠IPITT血糖-時(shí)間曲線(xiàn)，利用SPSS 20.0軟件計(jì)算出曲線(xiàn)下面積（AUC）。血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)：大鼠處死前，過(guò)夜禁食12 h后，經(jīng)頸靜脈采血測(cè)定血糖、三酰甘油、總膽固醇等血清學(xué)指標(biāo)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定空腹胰島素水平。血壓及心率檢測(cè)：大鼠處死前，采用大鼠尾動(dòng)脈血壓測(cè)量?jī)x分別測(cè)定每只大鼠尾動(dòng)脈血壓和心率，重復(fù)測(cè)定3次，間隔2 min測(cè)1次，求取平均值。超聲心動(dòng)圖檢測(cè)：大鼠處死前，于腹腔注射10%水合氯醛將大鼠麻醉，仰臥固定，胸前備皮并涂抹超聲耦合劑，采用Vevo770高分辨率小動(dòng)物超聲儀測(cè)定大鼠左心室收縮末期內(nèi)徑（VESD）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室短軸縮短率（FS），并計(jì)算出左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）；分別利用脈沖多普勒頻譜技術(shù)與連續(xù)多普勒頻譜技術(shù)測(cè)定二尖瓣舒張?jiān)缙谘魉俣确逯担‥）、二尖瓣舒張晚期血流速度峰值（A）、E/A比值、E波減速時(shí)間（EDT）與等容舒張時(shí)間（VRT）。

1.6 HE染色檢測(cè)心肌病理變化心肌組織在4%多聚甲醛溶液中固定24～48 h后；常規(guī)脫水、石蠟包埋；以4 μm厚度切片，65℃烤箱中烤片1 h；用二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化；蘇木精液染色5 min；水沖洗后，1%鹽酸乙醇分化5 s；水沖洗、乙醇處理后，酸化伊紅溶液染色2 min；乙醇脫水、二甲苯透明；用中性樹(shù)膠封片、烘烤過(guò)夜。用倒置相差顯微鏡觀察并拍照。

1.7 western blot檢測(cè)心肌自噬相關(guān)蛋白及AMPK、Akt、mTOR蛋白表達(dá)取出液氮凍存的心肌組織，充分研磨，加入適量蛋白緩沖液，采用常規(guī)方法提取蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，調(diào)好蛋白濃度。取蛋白樣品50 μg，與上樣緩沖液等體積混合；SDS-PAGE電泳；轉(zhuǎn)至NC膜，浸入含5%脫脂奶粉TBST溶液，避光封閉1 h；TBST洗滌后，置于一抗稀釋液（AMPK、p-AMPK、Akt、p-Akt稀釋比為1:200，Beclin1、LC3-Ⅰ/Ⅱ、mTOR、p-mTOR稀釋比為1:300）中，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗滌后，浸入二抗稀釋液（1:3000），室溫緩慢振蕩孵育1 h；TBST洗滌后，滴加ECL發(fā)光液，曝光3次，選取重疊值。蛋白條帶灰度值用Image J軟件進(jìn)行分析。用β-actin作為內(nèi)參蛋白。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本研究利用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2型糖尿病大鼠模型建立情況與對(duì)照組比較，糖尿病模型組大鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿、消瘦等癥狀。死亡情況：模型組大鼠死亡2只，麥冬皂苷低、中劑量組各死亡1只，最終共有54只大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。高脂飲食3個(gè)月后，IPGTT和IPITT檢測(cè)證實(shí)了糖尿病模型組大鼠出現(xiàn)胰島素抵抗情況。IPGTT結(jié)果顯示，糖尿病模型組大鼠血糖AUC顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。IPITT結(jié)果亦顯示，糖尿病模型組大鼠血糖AUC顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）（圖1、表1）。

2.2 麥冬皂苷對(duì)糖尿病大鼠代謝指標(biāo)及血壓的影響各組大鼠的血壓、體重之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對(duì)照組比較，模型組大鼠空腹血糖、空腹胰島素、心率、三酰甘油、總膽固醇、心臟重量顯著提高（P＜0.05）；與模型組比較，麥冬皂苷干預(yù)后大鼠空腹血糖、空腹胰島素、心率、三酰甘油、總膽固醇、心臟重量顯著降低（P＜0.05），且具有劑量依賴(lài)關(guān)系（表2）。

2.3 麥冬皂苷對(duì)糖尿病大鼠左心室結(jié)構(gòu)的影響HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組大鼠左心室室壁增厚，心肌細(xì)胞肥大、變形、排列紊亂，細(xì)胞間隙增加，細(xì)胞核大小不一致；與模型組比較，高劑量麥冬皂苷或羅格列酮干預(yù)后，大鼠左心室肥大癥狀有所改善（圖2）。

圖1 高脂飲食下大鼠出現(xiàn)胰島素抵抗情況

表1 大鼠血糖曲線(xiàn)下面積（AUC）（x±s）

表2 各組大鼠代謝指標(biāo)及血壓檢測(cè)結(jié)果（x±s）

2.4 麥冬皂苷對(duì)糖尿病大鼠心臟功能的影響超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠心臟E/A比值顯著降低、EDT和IVRT顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）；與模型組比較，麥冬皂苷各劑量組大鼠心臟E/A比值顯著升高、EDT和IVRT顯著縮短（P＜0.05），且具有劑量依賴(lài)關(guān)系（表3）。

2.5 麥冬皂苷對(duì)糖尿病大鼠心臟組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠心臟組織Beclin1/GAPDH、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)比值顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，麥冬皂苷各劑量組大鼠心臟組織Beclin1/GAPDH、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)比值顯著升高（P＜0.05），且具有劑量依賴(lài)關(guān)系（圖3、表4）。

圖2 各組大鼠心臟左心室橫切面HE染色結(jié)果（×100）

2.6 麥冬皂苷對(duì)糖尿病大鼠心臟組織AMPK、Akt、mTOR及其磷酸化水平的影響western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠心臟組織p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)比值顯著升高、p-Akt/Akt與p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)比值顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，麥冬皂苷各劑量組大鼠心臟組織p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)比值顯著降低（P＜0.05），p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)比值顯著升高（P＜0.05），且具有劑量依賴(lài)關(guān)系（圖4、表5）。

3 討論

糖尿病是一種很常見(jiàn)的非傳染性疾病，糖尿病性心肌病（DCM）是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)[8]，引發(fā)DCM的主要原因?yàn)樾募〖?xì)胞能量代謝失常，即葡萄糖代謝減少、脂代謝增加，造成心肌脂毒性損傷而引起氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、線(xiàn)粒體功能失調(diào)、心肌凋亡壞死等病理學(xué)變化，最終引發(fā)心肌病理性肥厚和心功能障礙。DCM發(fā)病初期難以診斷，治療常被延誤，造成預(yù)后不良，因此DCM早期防治極為重要[9]。本研究經(jīng)高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)成功建立2型糖尿病模型，大鼠出現(xiàn)高血糖、高血脂、胰島素抵抗等典型癥狀，并在此基礎(chǔ)上用麥冬皂苷進(jìn)行干預(yù)治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠出現(xiàn)左心室肥大、心肌收縮功能下降等明顯心肌損傷，而麥冬皂苷干預(yù)后可明顯改善糖尿病引起的心肌損傷。

自噬是真核生物獨(dú)特的修復(fù)機(jī)制，其通過(guò)消化受損的蛋白質(zhì)與細(xì)胞器，在應(yīng)激狀態(tài)下，消化自身成分為細(xì)胞提供養(yǎng)分與能量，進(jìn)而保證細(xì)胞內(nèi)部穩(wěn)態(tài)與結(jié)構(gòu)完整。自噬是一種精細(xì)的生物學(xué)過(guò)程，主要包括微自噬、巨自噬、分子伴侶介導(dǎo)的自噬三種類(lèi)型。微自噬指溶酶體直接吞噬并降解胞質(zhì)成分；巨自噬指內(nèi)質(zhì)網(wǎng)包裹待降解物后與溶酶體融合，從而使其內(nèi)容物降解；分子伴侶介導(dǎo)的自噬指熱休克蛋白識(shí)別胞質(zhì)成分后送至溶解體降解。目前有關(guān)巨自噬的研究最多，自噬異?？蓪?dǎo)致多種疾病的發(fā)生[10,11]。心肌細(xì)胞自噬對(duì)維持正常的心臟大小、結(jié)構(gòu)及功能至關(guān)重要[12]，麥冬皂苷的心臟保護(hù)作用是否通過(guò)影響心肌細(xì)胞自噬而實(shí)現(xiàn)，目前尚未研究。自噬過(guò)程需要自噬因子的參與。Beclin1是哺乳動(dòng)物第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的自噬基因，其與Vps34結(jié)合后促進(jìn)自噬小體的形成，為細(xì)胞自噬的正向調(diào)節(jié)因子[13]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，為自噬體產(chǎn)生的標(biāo)志。LC3包括Ⅰ型與Ⅱ型，LC3-Ⅰ位于胞漿內(nèi)，其與磷脂酰乙醇胺結(jié)合后形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ定位于自噬體膜，與Beclin1表達(dá)相一致，常被用于衡量細(xì)胞自噬的程度[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠心肌Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平顯著下調(diào)，麥冬皂苷干預(yù)后明顯上調(diào)了心肌Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)，說(shuō)明2型糖尿病大鼠的心肌自噬程度明顯降低，心肌肥厚，而麥冬皂苷干預(yù)可促進(jìn)心肌自噬，改善心臟功能。

表3 各組大鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果（x ±s）

圖3 麥冬皂苷對(duì)糖尿病大鼠心臟組織Beclin1、LC3表達(dá)的影響

表4 大鼠心臟組織Beclin1/GAPDH、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（x±s）

圖4 麥冬皂苷對(duì)糖尿病大鼠心臟組織AMPK、Akt、mTOR及其磷酸化水平的影響

表5 大鼠心臟組織p-AMPK/AMPK、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值（x±s）

腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是一種絲/蘇氨酸激酶，由α、β、γ三個(gè)亞單位組成，其通過(guò)感知能量狀態(tài)進(jìn)而維持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)，在細(xì)胞生長(zhǎng)、自噬、凋亡等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)[15,16]，糖尿病可造成心肌AMPK磷酸化水平下調(diào)，而AMPK介導(dǎo)的自噬水平也下調(diào)。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）也是一種絲/蘇氨酸激酶，在正常生理?xiàng)l件下，mTOR下調(diào)自噬通路，以維持基礎(chǔ)自噬水平。在細(xì)胞饑餓狀態(tài)下，mTOR功能受到抑制，自噬通路AMPK/mTOR被激活[17]。蛋白激酶B（Akt或稱(chēng)PKB）同樣也是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，它可協(xié)同磷脂酰肌醇依賴(lài)性蛋白激酶1/2促進(jìn)三磷酸磷脂酰肌醇與其自身結(jié)合，Akt由胞漿轉(zhuǎn)移至質(zhì)膜并發(fā)生磷酸化，Akt活化后可激活下游蛋白mTOR[18]。AMPK/mTOR與Akt/mTOR是兩條經(jīng)典的自噬信號(hào)通路[19,20]。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠心臟組織AMPK的磷酸化水平顯著升高、Akt與mTOR的磷酸化水平顯著降低，麥冬皂苷干預(yù)后心臟組織p-AMPK/AMPK比值顯著降低、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR比值顯著升高，說(shuō)明麥冬皂苷可能通過(guò)促進(jìn)AMPK磷酸化，抑制Akt和mTOR磷酸化，進(jìn)而增強(qiáng)心肌的自噬程度。

綜上所述，本研究結(jié)果表明麥冬皂苷可能通過(guò)活化AMPK，抑制Akt/mTOR通路，促進(jìn)心肌組織自噬，同時(shí)發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ表達(dá)上調(diào)，從而改善糖尿病引起的大鼠心臟功能受損，為麥冬皂苷臨床治療糖尿病性心肌病提供一定的參考價(jià)值。