張澤瀚，吉 喆，姜 橫，林 濤，孟怡辰*，周許輝*

1.海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院骨科，上海 200003

2.海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)員五隊(duì)，上海 200433

3.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院骨科中心，新疆維吾爾自治區(qū) 831000

青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸（AIS）是指冠狀位彎曲＞10°并伴有椎體旋轉(zhuǎn)的一種脊柱三維畸形［1］。AIS的病因仍然未知，雙胞胎研究和家族聚集研究顯示遺傳作用在AIS的發(fā)生過程中起到了重要作用［2-4］。但截至目前，只有AKAP2基因和POC5基因被證實(shí)可以導(dǎo)致AIS［5-6］。此外，幾項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)確定GPR126、CHL1和LBX1基因中的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)與AIS發(fā)生相關(guān)［7-8］。這些研究結(jié)果均表明AIS具有遺傳異質(zhì)性。本研究試圖通過全基因組測序的方法來探索中國漢族AIS患者中呈復(fù)合雜合隱性遺傳的致病基因。

1 資料與方法

1.1 研究對象

招募1個(gè)漢族AIS家系。家系的先證者在15歲時(shí)被確診為AIS，她的雙胞胎妹妹表現(xiàn)出與先證者相似的側(cè)凸類型，其他家庭成員（父母）沒有明顯的脊柱側(cè)凸病史。所有家庭成員均拍攝全脊柱正側(cè)位X線片。由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的矯形外科醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行體格檢查和病史回顧。AIS定義為脊柱冠狀面?zhèn)韧骨龋?0°并伴有椎體旋轉(zhuǎn)，無先天性畸形。本研究經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，參與研究的家系成員均于研究前簽署了書面知情同意書。

1.2 檢測方法

使用血液DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Blood Mini Kit，德國Qiagen公司）從受試者（先證者及其父母）外周血中提取DNA樣品，儲(chǔ)存于-20℃冰箱備用。用1%瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估DNA的完整性并使用Applied Biosystem SOLiD 4.0系統(tǒng)進(jìn)行全基因組測序（WGS），依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)SOLiD分析工作流程對主要測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用SOAPaligner程序?qū)υ夹蛄凶x數(shù)并與參考基因組（hg19）進(jìn)行比對。選擇非同義（NS）變體、剪接（SS）變體以及插入或缺失（indel）變體3種可能更具致病性的變體類型研究潛在致病突變。調(diào)用SNP對候選基因進(jìn)行優(yōu)先排序分析，比對讀數(shù)去除dbSNP、HapMap、1000 Genomes、ESP6500、ExAC以及中國內(nèi)地外顯子數(shù)據(jù)庫（1 500個(gè)中國漢族個(gè)體）中存在的序列變異［9］。使用SIFT（sift.bii.a-star.edu.sg/）、Polyphen-2（genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）和MutationTaster（www.mutationtaster.org/）預(yù)測有破壞性的單核苷酸變異（SNV）。

1.3 驗(yàn)證方法

使用Primer 5程序（https://frodo.wi.mit.edu/）設(shè)計(jì)PCR引物，對基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在ABI 3130 DNA分析儀上進(jìn)行雙向DNA Sanger測序驗(yàn)證所有發(fā)現(xiàn)的突變。

2 結(jié) 果

本研究納入了了一個(gè)二代家庭，先證者主胸彎Cobb角為46°，于2015年在長征醫(yī)院接受了矯形手術(shù)（圖1a，b），其妹妹具有相似的側(cè)凸，Cobb角21°，未接受治療，密切臨床隨訪中（圖1c，d），其他家庭成員（父母）沒有脊柱畸形表現(xiàn)，AIS在這個(gè)家庭中表現(xiàn)為隱性遺傳或新發(fā)性狀（de novo）。WGS在鑒定常染色體隱性遺傳方面已被證明非常成功。本研究準(zhǔn)備了先證者及其父母3個(gè)人的基因組文庫，獲得了平均深度為38.15×、人均830.87 Mb的序列，測序的數(shù)據(jù)詳見表1。

圖1 全脊柱X線片F(xiàn)ig. 1 Whole spine roentgenographs

表1 WGS數(shù)據(jù)Tab. 1 Data of WGS

將平均99.50%原始序列讀數(shù)與參考基因組（hg19）進(jìn)行比對，分析2種模式（隱性遺傳或新發(fā)性狀）可能性，其中新發(fā)性狀所有識(shí)別的突變都呈假陽性，只有復(fù)合雜合隱性遺傳模式符合該家系遺傳模式。先證者存在NS/SS/indel變體，但其父母不存在變體。排除所有數(shù)據(jù)庫中頻率＞0.01%的突變，考慮到大多數(shù)致病變體可能影響高度保守的序列和/或被預(yù)測為有害，使用SIFT、PolyPhen-2和MutationTaster的預(yù)測程序得分來預(yù)測變體的功能影響，得到8個(gè)基因，其中7個(gè)基因在功能上無關(guān)而排除（表2），只有DOCK9基因的2個(gè)突變保留作為候選變體：外顯子30中的錯(cuò)義突變c.3259T＞C（p.F1087L，NM_001130050）和外顯子22中的錯(cuò)義突變 c.2465A＞G（p.Y822C，NM_001130050）。2種突變均通過Sanger測序證實(shí)（圖2），并且突變位點(diǎn)在不同物種氨基酸水平上高度保守（圖3）。在該家系中，先證者DOCK9基因中存在該復(fù)合型雜合突變，經(jīng)驗(yàn)證，其妹妹的DOCK9基因中也存在該復(fù)合型雜合突變，而未發(fā)現(xiàn)既往報(bào)道的基因突變（POC5、AKAP2）。其母攜帶錯(cuò)義突變p.F1087L，其父攜帶錯(cuò)義突變p.Y822C，據(jù)此推測DOCK9突變基因很可能是AIS的發(fā)生原因。

表2 WGS排除基因Tab. 2 Excluded gene of WGS

圖2 Sanger測序驗(yàn)證DOCK9突變Fig. 2 Sanger sequencing for verifying DOCK9 mutation

圖3 突變位點(diǎn)在不同物種之間具有高度保守性Fig. 3 Mutation sites with highly evolutionary conservation between multiple species

3 討 論

AIS的病因尚不明確，但是既往的流行病學(xué)研究顯示，直系親屬中存在AIS患者，AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較高，而且在雙胞胎研究中，同卵雙胞胎同時(shí)出現(xiàn)脊柱側(cè)凸表型的比例（73%）明顯高于異卵雙胞胎（36%）［10］，表明遺傳因素在AIS發(fā)生過程中起到關(guān)鍵作用。近年研究已證實(shí)AKAP2、POC5為AIS的致病基因［5-6］，GPR126、CHL1和LBX1基因也與AIS發(fā)生相關(guān)［7-8］。但是這些基因只能解釋少部分AIS患者的發(fā)病機(jī)制，還有大部分患者的發(fā)病原因不能用已經(jīng)報(bào)道的突變基因解釋。

本研究對1個(gè)漢族AIS雙胞胎家系進(jìn)行了探究，通過測序發(fā)現(xiàn)，位于DOCK9基因30號(hào)外顯子的錯(cuò)義突變c.3259T＞C（p.F1087L）和位于DOCK9基因22號(hào)外顯子的錯(cuò)義突變c.2465A＞G（p.Y822C）可能是該家系A(chǔ)IS發(fā)生的原因。該家系中的2名患者在DOCK9基因中都存在該復(fù)合型雜合突變，先證者父親僅攜帶p.Y822C突變，其母僅攜帶p.F1087L突變。DOCK9基因位于13號(hào)染色體長臂32.3區(qū)域，有61個(gè)外顯子。其編碼的DOCK9蛋白屬于Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子，通過將鳥苷二磷酸轉(zhuǎn)化為鳥苷三磷酸而激活Rho鳥苷三磷酸酶，進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞的遷移、極性，細(xì)胞骨架的組裝以及細(xì)胞凋亡［11］。DOCK9可特異性地與cdc42結(jié)合形成復(fù)合體。Choi等［12］研究發(fā)現(xiàn)，cdc42基因敲除的斑馬魚模型出現(xiàn)脊柱側(cè)凸的表型；而對斑馬魚進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)，其神經(jīng)管內(nèi)的纖毛發(fā)育異常。纖毛是一類傳遞化學(xué)及機(jī)械信號(hào)的細(xì)胞器，在人類組織中（除血細(xì)胞）廣泛存在。Grimes等［13］研究發(fā)現(xiàn)，ptk7基因突變的斑馬魚室管膜細(xì)胞纖毛發(fā)育和腦脊液循環(huán)出現(xiàn)障礙，表現(xiàn)出類似于AIS的表型，證實(shí)ptk7基因突變斑馬魚是研究AIS的理想動(dòng)物模型，也為纖毛功能障礙在AIS的發(fā)生中發(fā)揮重要作用提供了證據(jù)。此外，Baek等［14］已經(jīng)證明，Tuba蛋白的缺乏可導(dǎo)致斑馬魚纖毛發(fā)育障礙，出現(xiàn)脊柱畸形的表型，而Tuba與DOCK9具有相同的功能。Oliazadeh等［15］研究發(fā)現(xiàn)，AIS患者成骨細(xì)胞纖毛長度較正常人的成骨細(xì)胞長，而纖毛的長度與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的強(qiáng)弱有關(guān)；因此，也認(rèn)為纖毛的功能異常在AIS的發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用。因此，本研究組推測DOCK9-cdc42途徑可能在纖毛發(fā)育中起關(guān)鍵作用，而其通路異常可能導(dǎo)致脊柱彎曲，出現(xiàn)AIS表型。下一步將繼續(xù)圍繞DOCK9在纖毛發(fā)育中的具體作用進(jìn)行深入的機(jī)制研究。

總之，本研究首次發(fā)現(xiàn)AIS患者家族中DOCK9基因突變的存在，并且以復(fù)合型雜合隱性方式遺傳給后代。今后需要構(gòu)建動(dòng)物模型對DOCK9在纖毛發(fā)育中的具體機(jī)制進(jìn)行深入探討，以解釋DOCK9基因突變在AIS發(fā)生機(jī)制中的作用。