■ 黃婧溪 夏超篤 羅龍軍 馮定遠 葉 慧 曹慶云 戰(zhàn)曉燕 左建軍*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510642；2.上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)系，上海201699)

在抗生素殘留與禁用的大背景下，選擇綠色健康的添加劑勢在必行。酵母細胞壁多糖(yeast polysaccharides，YPS)，一種從酵母細胞壁中提取的大分子的多糖復(fù)合物，廣泛存在于酵母和真菌的細胞壁中[1]，是具有抗生素兼益生素雙重作用的免疫促進劑，憑借其天然高效、無殘留、無耐藥性等優(yōu)點而得到廣大養(yǎng)殖戶的關(guān)注和認可，已經(jīng)成為當(dāng)今研究熱點之一[2]。

YPS具有提高動物生長性能、胴體品質(zhì)、機體免疫力和吸附霉菌毒素、抗病毒及抗氧化等多種生物學(xué)功能。主要分為三層，內(nèi)、外層分別為甘露寡糖和β-葡聚糖，起識別及決定酵母免疫特異性作用；中間層為糖蛋白質(zhì)層，其作用是保持細胞壁的穩(wěn)定性，維持其形態(tài)結(jié)構(gòu)[3]。王輝田等(2013)的研究表明，在22～42日齡及整個試驗期內(nèi)，與對照組相比，日糧中添加1 000、1 500、2 000 mg/kg的YPS均顯著提高了日增重，并顯著降低了料肉比(P＜0.05)[4]。已經(jīng)有許多研究報道表明酵母細胞壁具有抗生素兼益生素雙重作用的免疫促進劑[5]。

由于現(xiàn)在市場上出售很多酵母類產(chǎn)品，大多將其應(yīng)用到畜禽飼料中只是針對某些特定功能，然而并沒有一種系統(tǒng)評價其應(yīng)用到畜禽飼料中對黃羽肉雞抗氧化及免疫的效果。因此，本試驗選擇市場上出售的兩種酵母細胞壁多糖，將其添加到黃羽肉雞飼料中，通過飼養(yǎng)試驗并結(jié)合體外的檢測試驗研究酵母細胞壁對黃羽肉雞抗氧化及免疫功能的影響，旨在為酵母細胞壁在黃羽肉雞飼料中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及儀器

試驗所用兩種酵母細胞壁多糖產(chǎn)品A和B分別購自市場。其中A產(chǎn)品成分為：粗蛋白質(zhì)≥32%，甘露寡糖≥14%；B產(chǎn)品成分為：粗蛋白質(zhì)≤35%，甘露寡糖≥20%，β-葡聚糖20%～30%?？偝趸锲缁?T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)等血清指標試劑盒均購自南京建成生物工程所。Mouse Anti-Chicken CD3-SPRD(CLONE：CT-3)、Mouse Anti-Chicken CD4-FITC(CLONE：CT-4)、Mouse Anti-Chicken CD8a-PE(CLONE：CT-8)、Mouse IgG1?-SPRD(CLONE：15H6)、Mouse IgG1?-FITC(CLONE：15H6)、Mouse IgG1?-PE(CLONE：15H6)(美國SouthernBiotech公司)，溶血素(聯(lián)科生物)、流式上樣管（美國BD公司）、流式細胞儀（FC-500，美國貝克曼庫爾特公司）。

1.2 試驗動物及分組

選取1日齡黃羽肉雞(公雞)1 260只隨機分成A、B、C共3個處理組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)70只雞。經(jīng)統(tǒng)計檢驗，各組間試驗雞的平均體重差異不顯著(P＞0.05)。試驗分兩個階段進行，即1～21和22～42日齡。處理組A飼喂基礎(chǔ)日糧，處理組B、C分別飼喂添加0.1%酵母細胞壁多糖產(chǎn)品A和B的基礎(chǔ)日糧。試驗日糧以玉米和豆粕為主要原料，同時參考肉雞的NRC(1994)和中國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準(NY/T 33-2004)配制。試驗雞只自由采食和飲水。所有免疫及管理均嚴格按照廣東溫氏食品集團有限公司雞場規(guī)程執(zhí)行。試驗分組情況見表1，各階段飼糧配方及營養(yǎng)水平見表2。

表1 試驗分組情況

1.3 測定指標

生長指標的測定：分別于兩個試驗階段(21 d和42 d)結(jié)束前，禁食(自由飲水)12 h后稱重，計算第21 d及42 d的平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)及料重比(F/G)。

免疫器官指數(shù)的測定：將已經(jīng)剝離周圍脂肪的胸腺、脾臟、法氏囊稱重，起重量與體重的比值，即為胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)。

血清生化指標的測定：42日齡時，各處理組每個重復(fù)隨機抽取2只接近平均體重的雞，頸靜脈采血，其中一支分離血清，3 000 r/min離心10 min，取上清液，-30℃保存用于血清指標測定；另一支用加有EDTA抗凝劑的采血管采集2～3 ml全血，用于外周血淋巴細胞亞群的檢測。外周血T淋巴細胞亞群測定：在流式上樣管中分別加入Mouse Anti-Chicken CD3-SPRD、Mouse Anti-Chicken CD4-FITC、Mouse Anti-Chicken CD8a-PE各10 μl，另一支中加入相應(yīng)的同型對照試劑 Mouse IgG1?-SPRD、Mouse IgG1?-FITC、Mouse IgG1?-PE 各10 μl。取雞外周抗凝血（EDTAK2抗凝）50 μl，分別加入以上兩管中，震蕩混勻，室溫避光靜置20 min。加入溶血素500 μl，在渦旋震蕩器上劇烈震蕩0.5～1 min，靜置30 min左右，直至溶液變得完全透明，再加磷酸緩沖液1 ml，混勻，上流式儀檢測。收集淋巴細胞5 000個，分別計算CD3+、CD4+、CD8+的百分率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

用EXCEL對數(shù)據(jù)進行初步的整理，用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，各指標用One-way ANOVA進行顯著性分析，用LSD法進行多重比較，結(jié)果用“平均數(shù)±標準誤”表示。

表2 黃羽肉雞基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母壁多糖對黃羽肉雞生長性能的影響

1～21日齡各處理組的生長性能見表3。各處理組之間的平均日增重、平均日采食量、料重比均無顯著性差異(P＞0.05)，而B組和C組的成活率顯著高于對照組(P＜0.05)；與對照組相比，C組的平均日增重及平均日采食量有所下降。

表3 日糧中添加不同的YPS對1～21日齡黃羽肉雞生長性能的影響

22～42日齡各處理組的生長性能見表4。與對照組相比，B組平均日增重、平均日采食量及料重比均提高，而C組除平均日增重外，平均日采食量及耗料增重比分別降低了0.65%和0.81%。此外，處理組B、C的成活率均下降0.21%。綜上所述，飼料中添加YPS對1～21日齡的成活率及22～42日齡肉雞的生長性能具有一定的提高。

2.2 酵母壁多糖對黃羽肉雞免疫器官指數(shù)的影響

日糧中添加不同的YPS對21日齡肉雞免疫器官指數(shù)的影響見表5。由表5可知，除B組的胸腺指數(shù)低于A組和C組外，處理組B、C的脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)均高于對照組A；其中，B組脾臟指數(shù)顯著高于對照組A(P＜0.05)。

表4 日糧中添加不同的YPS對22～42日齡黃羽肉雞生長性能的影響

表5 日糧中添加不同的YPS對21日齡黃羽肉雞免疫器官指數(shù)的影響

42日齡各處理組免疫器官指數(shù)見表6。由表6可知，各處理組間肉雞的免疫器官指數(shù)各指標均無顯著性差異。與對照組相比，B組和C組的脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)均提高；相對于對照組，C組的法氏囊指數(shù)提高了15.52%，而B組的法氏囊指數(shù)有所下降。綜上，飼糧中添加了酵母細胞壁多糖可以顯著地提高21日齡肉雞脾臟指數(shù)，胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)也有不同程度的提高。

表6 日糧中添加不同的YPS對42日齡黃羽肉雞免疫器官指數(shù)的影響

2.3 酵母壁多糖對黃羽肉雞血清抗氧化能力的影響

日糧添加不同的YPS對42日齡黃羽肉雞血清抗氧化指標的影響見表7。由表7可知，與對照組A相比，B組和C組的GSH-Px和SOD均有所提高但差異不顯著，T-AOC呈顯著差異(P＜0.05)，分別提高了15.41%和14.47%?？傊c對照組相比，添加了酵母細胞壁多糖黃羽肉雞血清的不同抗氧化指標都有不同程度的提高。

表7 日糧中添加不同的YPS對42日齡黃羽肉雞血清抗氧化能力的影響

2.4 酵母壁多糖對黃羽肉雞外周血T淋巴細胞亞群的影響

42日齡各處理組肉雞外周血T淋巴細胞亞群見表8。相對于對照組，C組的CD3+顯著性提高(P＜0.05)，B組提高不顯著；B組和C組的CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均未出現(xiàn)顯著性差異。綜上所述，飼糧中添加YPS可以顯著地提高外周血中CD3+T淋巴細胞亞群的比例，提高CD4+和CD4+/CD8+，同時降低CD8+T淋巴細胞亞群的比例。

表8 日糧中添加不同的YPS對42日齡黃羽肉雞外周血T淋巴細胞亞群的影響

3 討論

3.1 酵母壁多糖對黃羽肉雞生長性能的影響

研究報道，飼料中添加YPS能夠提高畜禽的生長性能，主要因為富含甘露寡糖和葡聚糖，不但能夠吸附飼料中的霉菌毒素，諸如黃曲霉毒素、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮等，還可以結(jié)合機體腸道內(nèi)有害菌表面的凝集素，從而通過降低飼料中的毒素含量和調(diào)節(jié)腸道微生物菌群平衡來提高機體營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，間接地提高了動物的采食量和日增重，以及在一定程度上降低了耗料增重比[6-7]。Karaman等(2005)評估了酵母多糖對肉雞黃曲霉毒素中毒的解毒效果，酵母多糖有效降低了黃曲霉毒素對病理變化的不利影響，并且其本身沒有任何負面影響[8]。

本試驗研究顯示，兩階段各處理組之間的ADG、ADFI、F/G均無顯著性差異(P＞0.05)，而1～21日齡B組和C組的成活率顯著高于對照組(P＜0.05)。該結(jié)果與王輝田(2013)的研究基本一致，但在22～42日齡及整個試驗期內(nèi)，與對照組相比，日糧中添加1 000、1 500、2 000 mg/kg的YPS均顯著提高了日增重，并顯著降低了料肉比(P＜0.05)。譚本杰等(2011)研究表明，在肉雞日糧中添加酵母多糖能明顯提高肉雞生產(chǎn)性能，最適宜的添加水平為0.15%[9]。

3.2 酵母壁多糖對黃羽肉雞免疫器官指數(shù)的影響

動物的免疫器官是機體參與并發(fā)揮體液免疫以及細胞免疫的重要組織，在免疫物質(zhì)的合成、分泌以及抗原清除等方面發(fā)揮巨大的作用。因此，測定黃羽肉雞體內(nèi)脾臟、胸腺、法氏囊的相對器官指數(shù)可作為機體免疫功能強弱的間接反映。

本試驗研究表明，21日齡處理組B、C肉仔雞的脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)均高于A組，B組脾臟指數(shù)顯著高于A組(P＜0.05)；42日齡各處理組間肉雞的免疫器官指數(shù)各指標均無顯著性差異。李志清(2003)研究發(fā)現(xiàn)，肉仔雞免疫器官的發(fā)育同日糧中酵母細胞壁的添加量呈正相關(guān)[10]。張運濤等(1999)試驗結(jié)果表明，YPS可促進雛雞免疫器官的生長發(fā)育，對雛雞的免疫系統(tǒng)的成熟具有顯著的促進作用，其中對中樞免疫器官胸腺和法氏囊的刺激作用大于對外周免疫器官脾臟和盲腸扁桃體的作用，特別是對胸腺生長和成熟的促進作用最大[11-12]。而42日齡B組法氏囊指數(shù)與前人研究結(jié)果一致，其原因可能是法氏囊發(fā)育的個體差異。

3.3 酵母壁多糖對黃羽肉雞血清抗氧化能力的影響

動物機體內(nèi)存在著大量的自由基，自由基可以破壞機體的細胞膜，使細胞膜的通透性增大，從而使得細胞的滲透壓發(fā)生巨大的改變以及造成細胞死亡。然而在正常生命活動中，動物機體通過酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)清除活性自由基，減輕和阻止活性氧的過氧化作用，保持機體氧化系統(tǒng)的動態(tài)平衡[13]。血清中TSOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶對清除自由基提高機體抗氧化能力等方面發(fā)揮著重要的作用。

本試驗研究表明，與對照組A相比，日糧添加不同的YPS均對42日齡GSH-Px和SOD提高不顯著，但顯著提高B組和C組的T-AOC(P＜0.05)。Newsman K等(1993)研究發(fā)現(xiàn)，酵母多糖具有提高SOD的活力及清除過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛的作用，起到抗氧化、抗衰老作用[14]。黃鑫等(2014)研究了YPS與酵母硒聯(lián)用對肉雞免疫功能的影響，結(jié)果表明添加YPS和酵母硒促進了免疫器官的發(fā)育，增強了抗氧化能力并降低了死淘率[15]。周淑芹等(2009)研究結(jié)果表明，0.5%的酵母培養(yǎng)物提高了肉雞的SOD水平[16]。

3.4 酵母壁多糖對黃羽肉雞外周血T淋巴細胞亞群的影響

T細胞是機體免疫應(yīng)答的核心細胞，包括成熟型T細胞CD3+、輔助型T細胞 CD4+、細胞毒性T細胞或抑制型T細胞CD8+[17]。CD4+又可分為Th1和Th2亞群，Th2在IL-4的作用下促進B細胞的發(fā)育和抗體產(chǎn)生，從而進行體液免疫，同時IL-4競爭性的抑制Th1細胞及其介導(dǎo)的體液免疫。Th1在IL-2的作用下介導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答，并產(chǎn)生細胞因子IFN-γ，抑制Th2細胞及其介導(dǎo)的體液免疫。CD8+細胞可殺傷靶細胞和抑制B、T淋巴細胞的分化增殖。CD4+/CD8+降低意味著免疫激活程度低，故進行T細胞亞群檢測是研究免疫機制和評價免疫功能的重要技術(shù)[18]。

本試驗研究表明，與對照組相比，C組的CD3+顯著性提高(P＜0.05)，而CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均未出現(xiàn)顯著性差異。王權(quán)等(2002)研究結(jié)果表明，在飼料中添加5 g/kg甘露寡糖能明顯地促進T細胞增殖，提高T細胞百分率[19]。本試驗與高俊(2008)的研究結(jié)果基本一致，其研究表明，日糧中添加酵母培養(yǎng)物，外周血和脾臟中 CD3+、CD4+、CD8+百分含量以及 CD4+/CD8+比值增加[20]；于素紅(2008)研究表明，添加酵母培養(yǎng)物，提高了21日齡肉仔雞外周血淋巴細胞亞群中CD4+、CD8+水平，以及CD4+/CD8+、CD4+/CD3+的比值，增強了肉仔雞的細胞免疫水平[21]。

4 結(jié)語

綜上所述，日糧中添加0.1%的酵母細胞壁多糖，可以不同程度地提高肉雞的采食量和日增重、降低料重比，顯著提高1～21日齡的成活率；顯著提高42日齡肉雞血清的總抗氧化能力，對谷胱甘肽過氧化物酶以及超氧化物歧化酶活性也有提高的作用；顯著提高了外周血T淋巴細胞亞群CD3+的比例，同時也提高了CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+的比值。以上結(jié)果揭示了酵母細胞壁多糖通過改善肉雞抗氧化和免疫性能從而影響肉雞的生長性能并降低雛雞的死淘率，為酵母細胞壁多糖的抗生素替代應(yīng)用提供了理論依據(jù)。