周顯祝 鄒文斌,2 王越 李兆申,2 廖專(zhuān),2

1海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200433；2上海市胰腺病研究所，上海 200433；3海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，上海 200433

【提要】 慢性胰腺炎(CP)一種進(jìn)行性慢性炎癥疾病，其病理特征為胰腺腺泡萎縮、破壞和間質(zhì)纖維化，臨床上缺乏有效治療手段。干細(xì)胞治療是目前醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)方向之一，具有促進(jìn)病變損傷組織修復(fù)和功能性再生的能力，未來(lái)可能成為CP患者治療的新方式。本文介紹了干細(xì)胞相關(guān)技術(shù)應(yīng)用于CP治療的基礎(chǔ)研究現(xiàn)狀和臨床應(yīng)用前景。

慢性胰腺炎(CP)是指由于各種原因引起的胰腺組織發(fā)生進(jìn)行性炎癥反應(yīng)，反復(fù)或持續(xù)性的損傷胰腺腺泡和小管，導(dǎo)致胰腺內(nèi)、外分泌功能不足。CP的病因很復(fù)雜，與飲酒、吸煙、高脂血癥、胰腺分裂和遺傳因素等相關(guān)。CP治療主要是緩解癥狀，處理并發(fā)癥，以及保護(hù)并改善胰腺功能。針對(duì)CP的不同治療手段各有利弊，臨床常用的治療方式主要是藥物治療、內(nèi)鏡治療以及外科手術(shù)治療。藥物治療方面缺少有效抗炎和抗纖維化的藥物。內(nèi)鏡治療主要針對(duì)胰管梗阻性患者有效。外科手術(shù)治療創(chuàng)傷大，術(shù)后恢復(fù)慢，并發(fā)癥較多。因此采用更有效和微創(chuàng)的治療方式從根源上修復(fù)胰腺細(xì)胞與組織損傷是CP治療研究的發(fā)展趨勢(shì)。干細(xì)胞治療是目前醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)方向之一，具有促進(jìn)病變損傷組織修復(fù)和功能性再生的能力，未來(lái)可能成為CP患者治療的新方式。本文介紹干細(xì)胞治療CP的基礎(chǔ)研究現(xiàn)狀和臨床應(yīng)用前景。

一、干細(xì)胞的種類(lèi)與特點(diǎn)

干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新和多向分化增殖能力的原始細(xì)胞，能產(chǎn)生表型和基因型與自己完全相同的子細(xì)胞。既具有生理性的更新能力，又對(duì)損傷與疾病導(dǎo)致的反應(yīng)有修復(fù)功能。干細(xì)胞可分為3類(lèi)，包括：(1)全能干細(xì)胞，含胚胎干細(xì)胞、胚胎生殖嵴細(xì)胞、胚胎瘤細(xì)胞；(2)多能干細(xì)胞，目前研究較多的是骨髓來(lái)源的干細(xì)胞，它可以分化成肝細(xì)胞，也可能分化成為胰腺細(xì)胞； (3)定向干細(xì)胞，胰腺的定向干細(xì)胞包括胚胎胰腺干細(xì)胞、胰腺導(dǎo)管細(xì)胞、胰島來(lái)源干細(xì)胞。根據(jù)干細(xì)胞的發(fā)育階段還可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞有潛力由單個(gè)受精卵發(fā)育成為具有各種組織器官的完整個(gè)體，其分化和增殖構(gòu)成動(dòng)物發(fā)育的基礎(chǔ)；成體干細(xì)胞的進(jìn)一步分化則是成年動(dòng)物體內(nèi)組織和器官修復(fù)再生的基礎(chǔ)。 胰腺干細(xì)胞為成體干細(xì)胞，具有高度增殖及多向分化能力，具備分化成為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞、腺泡細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞的潛能[1]。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)于1976年首次從骨髓分離[2]，是一類(lèi)具有多向分化潛能和高度自我更新能力的成體干細(xì)胞，可分化成多種細(xì)胞系，包括中胚層譜系，如軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，以及外胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞[3]。 MSCs可以從骨髓、脂肪組織和臍帶中分離出來(lái)，且容易在體外擴(kuò)增。MSCs有以下特點(diǎn)：(1)必須在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下保持塑性貼壁; (2)表達(dá)CD105、CD73和CD90，但不表達(dá)CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19或HLA-DR；(3)可以體外分化成成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。2004年Le Blanc等[4]報(bào)道移植MSCs成功治療移植物抗宿主病患者，此后報(bào)道了多項(xiàng)MSCs臨床試驗(yàn)。起初MSCs治療側(cè)重于其多向分化的能力，近期一些研究表明，大部分系統(tǒng)性輸注的MSCs被困在肺內(nèi)作為栓子[5]。此外，在沒(méi)有分化和移植到受傷組織的疾病模型中，MSCs具有抑制炎癥、凋亡和纖維化的作用[6]。因此，目前臨床相關(guān)研究的重點(diǎn)方向已經(jīng)轉(zhuǎn)向利用MSCs的旁分泌和調(diào)節(jié)功能(如抗炎作用)而非其直接分化替代組織細(xì)胞的能力。

二、干細(xì)胞治療胰腺炎的研究現(xiàn)狀

目前干細(xì)胞治療主要用于胰腺炎動(dòng)物模型，其治療更常用于急性胰腺炎(AP)而非CP。研究中最常用的MSCs類(lèi)型是骨髓和臍帶來(lái)源干細(xì)胞。鼠MSCs是最常用的治療胰腺炎的干細(xì)胞，其次為人類(lèi)MSCs，極少數(shù)研究使用犬MSCs。

關(guān)于干細(xì)胞治療CP的研究[7-9]，目前尚沒(méi)有在人體上進(jìn)行。這些研究均將不同來(lái)源的干細(xì)胞通過(guò)靜脈注射于CP模型鼠，并在一段時(shí)間后觀察鼠胰腺情況。研究的主要差異是干細(xì)胞來(lái)源和注射劑量以及檢測(cè)療效的時(shí)間等方面[7-8]。Sun等[9]對(duì)小鼠施用低劑量的脂肪來(lái)源的MSCs(adipose-derived mesenchymal stem cells，ASCs)進(jìn)行治療。

三、干細(xì)胞治療CP的作用與機(jī)制

目前研究均觀察到干細(xì)胞治療對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的胰腺炎有明顯改善作用。發(fā)揮治療作用的途徑為兩種：旁分泌途徑和干細(xì)胞歸巢及定向分化后的細(xì)胞替代途徑。越來(lái)越多的研究表明旁分泌機(jī)制起主導(dǎo)作用，其分泌出特定細(xì)胞因子或抑制某些細(xì)胞因子的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎以及抗纖維化的作用[10]。有研究表明，人MSCs輸注可有效降低糖尿病小鼠的血糖水平，這種變化是通過(guò)增加小鼠中產(chǎn)生胰島素的胰島β細(xì)胞來(lái)介導(dǎo)的，表明高血糖的逆轉(zhuǎn)是通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)源性胰島的再生而不是將注射的MSCs直接分化為產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞[11]。旁分泌機(jī)制是目前更能被普遍認(rèn)可的發(fā)揮治療作用的方式，提示可將干細(xì)胞的分泌因子分離后直接輸送給患者。另一種途徑是干細(xì)胞歸巢至受損胰腺后，分化為受損器官的細(xì)胞進(jìn)行補(bǔ)充與修復(fù)。這種途徑的可能原因是胰腺的生理更新和損傷修復(fù)主要依靠胰腺干細(xì)胞和骨髓來(lái)源的干細(xì)胞。但在正常生理情況下，胰腺干細(xì)胞的數(shù)量并不能滿(mǎn)足胰腺損傷修復(fù)的需要，在胰腺損傷的自身修復(fù)過(guò)程中的作用相對(duì)較小。病理?yè)p傷時(shí)，自體骨髓MSCs可隨血液循環(huán)到達(dá)損傷的胰腺，轉(zhuǎn)化為胰腺干細(xì)胞，參與病理修復(fù)，從而恢復(fù)胰腺功能。從目前的結(jié)果來(lái)看，干細(xì)胞治療胰腺炎主要有以下幾方面效應(yīng)。

1．抗炎作用與旁分泌效應(yīng)：炎癥是CP病情進(jìn)展的基礎(chǔ)，目前的研究證明，ACSs能抑制乙醇和蛙皮素誘導(dǎo)炎癥的作用。將腺泡細(xì)胞與干細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，干細(xì)胞能顯著抑制腺泡細(xì)胞和胰腺星狀細(xì)胞TNF-α、IL-6等炎癥因子和纖連蛋白的表達(dá)。不僅如此，在ASCs條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)腺泡細(xì)胞也能達(dá)到類(lèi)似的效果。這種效應(yīng)可能是通過(guò)干細(xì)胞的旁分泌效應(yīng)所介導(dǎo)的，即干細(xì)胞分泌一些特殊遞質(zhì)到培養(yǎng)基中，遞質(zhì)作用于腺泡細(xì)胞，延緩甚至阻斷其炎癥因子的表達(dá)，從而達(dá)到抗炎的作用。

2．延緩纖維化：胰腺纖維化的核心環(huán)節(jié)是激活態(tài)的胰腺星狀細(xì)胞(pancreatic stellate cells，PSCs)分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)。在正常胰腺中，PSCs呈圓形和靜止?fàn)顟B(tài)，靜息態(tài)PSCs僅產(chǎn)生少量ECM。而在胰腺損傷的早期階段，靜息態(tài)PSCs在氧化應(yīng)激、乙醇等刺激下被激活，轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞，并分泌大量ECM。同時(shí)炎癥細(xì)胞與血小板以及活化的PSCs自身也產(chǎn)生炎癥遞質(zhì)，如單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)、細(xì)胞間黏附分子-1、IL-8，這些炎癥因子通過(guò)自分泌(作用于PSCs自身)與旁分泌作用(作用于炎癥細(xì)胞及血小板)形成環(huán)路，引發(fā)正反饋，加速炎癥的過(guò)程[12]。

3．抑制炎癥因子的產(chǎn)生：MCP-1在單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞向炎癥部位的趨化中起著核心作用[13-14]。在多種纖維化疾病(包括特發(fā)性肺纖維化、系統(tǒng)性硬化癥和CP)中均觀察到MCP-1的過(guò)度表達(dá)[15-17]，因此MCP-1水平可能是胰腺纖維化和炎癥的重要治療靶點(diǎn)。有研究表明，干細(xì)胞條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的PSCs，其MCP-1和IL-8的表達(dá)水平顯著下降[7-8]。目前文獻(xiàn)中普遍得出的結(jié)論是腺泡細(xì)胞和星狀細(xì)胞在干細(xì)胞條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，能減少乙醇及雨蛙素所誘導(dǎo)的炎癥因子產(chǎn)生，一方面能抑制激活態(tài)PSCs的自分泌效應(yīng)，一方面也可以通過(guò)旁分泌抑制炎癥細(xì)胞和血小板釋放炎癥遞質(zhì)，阻斷正反饋進(jìn)程，進(jìn)而抑制胰腺纖維化。

4．防止胰腺細(xì)胞死亡：最近Sun等[9]探討了干細(xì)胞靜脈輸注對(duì)CP模型小鼠胰腺細(xì)胞死亡的影響。通過(guò)特定的染色方法對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)在接受干細(xì)胞治療的CP模型小鼠中染色的凋亡細(xì)胞顯著減少，表明干細(xì)胞能保護(hù)胰腺細(xì)胞免受乙醇和蛙皮素所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，即腺泡細(xì)胞受損減少，其釋放的細(xì)胞因子也相應(yīng)減少，進(jìn)而減弱了PSCs細(xì)胞的活化，減緩了胰腺纖維化的進(jìn)程。

5．歸巢：干細(xì)胞有自主趨化至機(jī)體受損部位的特性。較新的研究結(jié)果表明，干細(xì)胞治療2周后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的胰腺中有干細(xì)胞熒光蛋白表達(dá)，而在肝臟或肺組織中無(wú)表達(dá)，表明干細(xì)胞經(jīng)過(guò)靜脈注射特異性地遷移到受損的胰腺處。Zhou等[7]的研究證實(shí)了該現(xiàn)象，在實(shí)驗(yàn)的第14天和第28天從大鼠的胰腺組織中檢測(cè)出了干細(xì)胞。由于膽管梗阻，肝功能受到一定程度的損害，因而在肝臟中也檢測(cè)到干細(xì)胞，表明靜脈輸注的干細(xì)胞可以有效地到達(dá)受損組織的靜脈內(nèi)。有研究報(bào)道，輸注干細(xì)胞的健康老鼠在第14天后于肺組織中鑒定出少量的干細(xì)胞，這是由于培養(yǎng)的MSCs直徑大于了微毛細(xì)血管(20 μm)的寬度，因此MSCs被阻塞在肺部毛細(xì)血管而無(wú)法通過(guò)[18]。但Eggenhofer等[19]研究發(fā)現(xiàn)不一樣的現(xiàn)象，通過(guò)尾靜脈對(duì)肝臟受損的小鼠注射綠色熒光蛋白標(biāo)記的MSCs后24 h，肝臟和脾臟中均發(fā)現(xiàn)熒光，但未能從這些器官中分離出活體MSCs，表明活體MSCs靜脈輸注后不能通過(guò)肺的毛細(xì)血管床，因此作者認(rèn)為先前在其他組織的一些研究檢測(cè)到的可能是來(lái)自MSCs碎片或被吞噬的MSCs，而不是活體MSCs標(biāo)記(例如放射性、熒光素標(biāo)記)。該研究表明，如果MSCs需要遞送到除肺以外的組織，則必須探討其他使用途徑，例如通過(guò)門(mén)靜脈給藥可將MSCs遞送至肝臟，而動(dòng)脈給藥可將MSCs遞送至特定器官。

6．分化：當(dāng)干細(xì)胞遷移到胰腺，通過(guò)干細(xì)胞綠色熒光蛋白與淀粉酶的共染色可以知道干細(xì)胞分化成了淀粉酶陽(yáng)性的細(xì)胞，且表達(dá)了大量的腺泡細(xì)胞特異性產(chǎn)物[9]，說(shuō)明體內(nèi)歸巢至受損胰腺的干細(xì)胞分化成了腺泡樣細(xì)胞。同時(shí)體外細(xì)胞培養(yǎng)的研究提供了進(jìn)一步的證據(jù)，即由腺泡細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子和信號(hào)分子可以導(dǎo)致干細(xì)胞向腺泡細(xì)胞方向分化。當(dāng)與腺泡細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，大鼠骨髓MSCs、人羊膜上皮細(xì)胞和人ASCs在體外已顯示出分化為唾液腺泡細(xì)胞的能力[20-21]。目前認(rèn)為，細(xì)胞間接觸和微環(huán)境釋放營(yíng)養(yǎng)因子(即旁分泌作用)似乎是驅(qū)動(dòng)干細(xì)胞分化的原因。然而并非所有MSCs都具有相同的分化能力。據(jù)報(bào)道，在唾液腺模型中13%～18%的ASC分化為淀粉酶陽(yáng)性細(xì)胞[22-23]。目前需要確認(rèn)是否只有其中一部分亞群的MSCs具有分化為特定細(xì)胞的潛力，或者目前分離出的ASCs是各種不同干細(xì)胞的混合，每個(gè)干細(xì)胞已經(jīng)有自己特定的分化方向，需要在各自特定環(huán)境中被觸發(fā)，例如這部分淀粉酶陽(yáng)性分化潛能的細(xì)胞在唾液腺模型中被觸發(fā)。

總之，目前研究表明，MSCs可分化為淀粉酶陽(yáng)性細(xì)胞，這種情況可以在細(xì)胞輸注體內(nèi)后發(fā)生，也可以在ASCs與腺泡細(xì)胞共培養(yǎng)或在腺泡細(xì)胞條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)(即體外)發(fā)生。

四、總結(jié)與展望

目前的研究已經(jīng)從治療效果角度闡明了干細(xì)胞能夠發(fā)揮抗炎，抑制纖維化進(jìn)展等作用，但缺少針對(duì)這些效應(yīng)的具體機(jī)制的研究。此外，缺少關(guān)于干細(xì)胞輸注后是否能緩解疼痛方面的研究。對(duì)于干細(xì)胞治療CP的另一個(gè)思路是體外誘導(dǎo)其分化為內(nèi)分泌或外分泌細(xì)胞后再植入體內(nèi)。內(nèi)分泌細(xì)胞植入的主要問(wèn)題是數(shù)量問(wèn)題，對(duì)于糖尿病患者，基于細(xì)胞療法旨在替代胰腺產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞。目前該方法已接近臨床上可行，但尚未達(dá)到取代外源胰島素注射治療糖尿病的程度。外分泌植入的問(wèn)題是位置問(wèn)題，必須實(shí)現(xiàn)移植的外分泌細(xì)胞產(chǎn)生的消化酶能通過(guò)導(dǎo)管遞送至腸腔。此外，與胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞替代療法不同，沒(méi)有證據(jù)證明外分泌細(xì)胞替代療法具有比目前的口服胰酶替代療法更安全、更有潛力?？傊瑢?duì)以上問(wèn)題的機(jī)制研究將可能有助于該領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展及加速臨床轉(zhuǎn)化的進(jìn)程。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突