楊瑩瑩，王 猛，劉 霞，張玉華，顧萍萍，張云杰

Toll受體(TLRs)是先天性免疫應(yīng)答的代表性受體，它可識別病原相關(guān)分子模式(PAMPS)，引導(dǎo)信號傳導(dǎo)通路，介導(dǎo)炎癥的發(fā)生，激活天然免疫反應(yīng)，并且可以提供共刺激信號，啟動機體的獲得性免疫反應(yīng)。目前關(guān)于缺血再灌注損傷的發(fā)病機理仍未明確，但仍有許多證據(jù)表明，與TLRs關(guān)系密切，其中以Toll-樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）所起作用的研究最為普遍，本文就以近年來TLR4在缺血再灌注損傷中應(yīng)用的研究進展作一綜述。

1 TLR4的結(jié)構(gòu)及其信號傳導(dǎo)通路

1980年，Nusslein-Volhard等[1]在對果蠅胚胎發(fā)育過程的研究中，第一次發(fā)現(xiàn)并命名了Toll基因。1996年，通過研究具有突變的果蠅，Jules Hoffmann等[2]證明了Toll基因的活性，從而確立了Toll的免疫學(xué)意義。隨后，在1997年Medzhitov等[3]人在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了第一個TLR相關(guān)蛋白，即TLR4受體。迄今為止，我們已在不同的物種發(fā)現(xiàn)了至少15 種TLR，其中TLR4 是最早發(fā)現(xiàn)且研究最深入的。

1.1 TLR4的結(jié)構(gòu) TLR4的組成部分主要有三個，包括細胞外區(qū)域、跨膜區(qū)域和細胞內(nèi)區(qū)域，其中胞外區(qū)主要用于特異性識別病原體及其產(chǎn)物，胞內(nèi)區(qū)主要參與對下游相關(guān)信號的激活作用。TLR4幾乎分布于人類所有的細胞系，其中在骨髓單核細胞、外周血白細胞和淋巴樣組織中的表達最為豐富[4]。TLR4作為一種模式識別受體，不僅可以識別外源性配體，如革蘭陰性菌的脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）、呼吸道合胞病毒融合蛋白、真菌表面的多聚糖；還可識別一些內(nèi)源性配體，如高遷移率 族 蛋 白 1(high mobility group box-protein 1，HMGB1)、熱休克蛋白60等[5]。

1.2 TLR4的信號傳導(dǎo)通路

1.2.1 細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)部分 TLR4的信號傳導(dǎo)途徑可根據(jù)不同的接頭分子分為兩種[6]。一是以MyD88為接頭分子的MyD88依賴的信號通路 （MyD88-dependent path-way），包括2條不同途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。其中一條是以NF-KB信號通路為引導(dǎo)，完成的炎癥信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。另一條通路—MAPK信號通路，是通過三級激酶級聯(lián)的方式來調(diào)控炎癥基因轉(zhuǎn)錄。二是以TRIF為接頭分子的非MyD88依賴的信號通路（MyD88-independent path-way），亦可以通過影響下游 NF-KB 的表達來介導(dǎo)炎癥的發(fā)生還可以通過對TRIF/IRF3的激活來實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄。

1.2.2 細胞外的信號傳導(dǎo)部分 LPS作為TLR4的主要識別配體，是革蘭陰性細菌細胞壁中的一種主要成分，由O-抗原、核心多糖和脂質(zhì)A組成。它可在髓樣分化蛋白-2的協(xié)助下完成TLR4的活化，從而實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]。

2 缺血再灌注損傷

缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）又稱再灌注損傷，是指組織器官（包括心、肝、肺、腎、胃腸道等）在缺血一段時間，血流恢復(fù)正常之后，細胞功能、代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞非但沒有恢復(fù)，反而比缺血時損傷的更嚴(yán)重。

1955年，Swell等[8]在動物實驗中首次發(fā)現(xiàn)，在結(jié)扎狗的心臟冠狀動脈后，如果結(jié)扎突然被解除，隨后恢復(fù)血流，就會出現(xiàn)一些動物當(dāng)即產(chǎn)生室顫而死亡的現(xiàn)象。1960年，Jennings等[9]通過實驗發(fā)現(xiàn)并初次提出了心肌缺血再灌注損傷。此后，關(guān)于其他器官缺血再灌注損傷的研究報道愈來愈多。

缺血再灌注損傷的發(fā)病機理極其復(fù)雜，依托大量的實驗和臨床研究，目前大多數(shù)學(xué)者認為，再灌注損傷的發(fā)生主要與炎性反應(yīng)、自由基生成過多、細胞內(nèi)Ca2+超載、興奮性氨基酸毒性和細胞凋亡等多種機制有關(guān)。而各種機制之間又密切維系，相互影響，最終促成了缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展。

3 TLR4對各器官缺血再灌注損傷的應(yīng)用進展

3.1 心肌缺血再灌注損傷 隨著人們對心肌缺血再灌注損傷發(fā)生機理研究的深入，TLR4介導(dǎo)的信號通路在其中的作用漸漸明了。Oyama[10]對缺乏TLR4表達的小鼠和TLR4表達正常的小鼠分別進行了心肌缺血再灌注試驗，對照結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TLR4信號通路缺失可減少小鼠缺血再灌注后發(fā)生心肌梗死的概率。而Li等[11]的研究表明，短暫的心肌缺血會通過MyD88依賴的信號通路引起IRAK-1的活化，從而證實了TLR4介導(dǎo)的信號通路在缺血再灌注損傷時對心肌細胞凋亡和炎癥起重要作用。

同時也有研究表明，TLR4通過誘導(dǎo)性一氧化氮合酶和可溶性鳥苷酸環(huán)化酶依賴機制對心肌缺血再灌注損傷提供了強有力的保護，這為抗缺血心肌保護提供了一種選擇性靶向TLR4-MyD88信號的治療策略[12]。Wang等[13]的紫檀芪對照實驗更是證實，抑制TLR4/NF-KB信號通路后，可以減少缺血再灌注后的細胞凋亡及炎癥反應(yīng)。

隨后越來越多的研究證明，不同物質(zhì)通過抑制或激活TLR4 介導(dǎo)的信號通路可達到保護缺血再灌注損傷心肌的作用。然而，目前對于能否通過抑制TLR4信號通路來緩解心肌炎癥并保護心臟功能還存在著質(zhì)疑。Kim等[14]研究表明，TLR4缺陷小鼠在缺血再灌注損傷后，其血清細胞因子水平降低和心肌梗死面積減小，但是心臟功能并未恢復(fù)。而Fallach等[15]的實驗結(jié)果則表明，TLR4可減少隨后的心肌梗死并改善心臟功能。因此，在調(diào)節(jié)TLR4信號傳導(dǎo)通路并避免在缺血再灌注時損傷心肌的同時，還需如何調(diào)節(jié)免疫功能是需要進一步研究的重要問題。

3.2 腦缺血再灌注損傷 腦缺血再灌注損傷引起的腦損傷是一種復(fù)雜的過程，其中炎癥反應(yīng)主要依賴于Toll受體中的TLR4，特別是一些內(nèi)源性配體、HMGB1、過氧化物還原酶家族蛋白都參與了浸潤巨噬細胞的激活和炎性細胞因子的表達，從而啟動炎性級聯(lián)反應(yīng)，在腦缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵性用途[16]。

多項研究表明，在腦缺血再灌注損傷發(fā)生時，TLR4可通過MyD88通路與TRIF通路加重腦組織的損傷[17]。有研究表明，TLR4通過MyD88依賴通路參與的免疫炎癥反應(yīng)，在大腦缺血再灌注早期可減輕腦組織損傷，而后期加重腦組織損傷[18]。

雖然其具體機制仍不明確，但卻為以TLR4為靶點的治療提供了指導(dǎo)意義。如Hua等[19]的研究證明，TAK-242可以通過抑制TLR4介導(dǎo)的信號通路和炎性細胞因子的表達，保護大腦免受缺血再灌注后的急性期損傷。有研究表明，羥基紅花黃色素可以通過抑制TLR4誘導(dǎo)的先天免疫通路來減少腦缺血損傷，從而改善神經(jīng)功能缺陷[20]。在腦缺血前予以電針刺激后，可以發(fā)現(xiàn)TLR4、NF-KB蛋白表達明顯減少，炎性損傷減輕，神經(jīng)功能缺損得到明顯改善。提示電針預(yù)處理可通過對TLR4、NF-KB蛋白表達的調(diào)控，抑制TLR4/NF-KB及其介導(dǎo)的炎性級聯(lián)反應(yīng)，減輕炎性損傷[21]。

然而，這些研究目前僅處于基礎(chǔ)研究水平，并不足以用于臨床應(yīng)用。因此，以TLR4 為靶點的藥物的研制與開發(fā)仍是我們目前研究的重點。

3.3 肝臟缺血再灌注損傷 肝臟缺血再灌注損傷不僅是一個涉及肝臟自身的生理病理過程，也是一個復(fù)雜的系統(tǒng)過程，影響多個組織和器官。肝臟缺血再灌注損傷會嚴(yán)重損害肝功能，甚至造成不可逆轉(zhuǎn)的損害，并引起多器官功能紊亂。

肝臟缺血再灌注損傷包括熱缺血和冷保存兩種類型，它們的病理改變及發(fā)病機制較為相似。肝臟缺血再灌注損傷的發(fā)病機制至今尚未完全闡明。目前已知，在肝臟缺血再灌注損傷過程中，涉及的因素包括無氧代謝、線粒體氧化過程異常、細胞內(nèi)鈣超載、肝枯否細胞和中性粒細胞、細胞因子和趨化因子的參與[22]。缺血再灌注損傷的發(fā)病機制是多種原因共同作用引起的，但所有的生理病理過程都有一個類似的信號通路——TLR 信號通路，尤其是TLR4，在缺血-再灌注損傷的炎癥階段具有基本的基礎(chǔ)作用。

之前有研究結(jié)果表明，TLR4可通過激活NF-KB信號在肝臟缺血再灌注損傷的發(fā)病機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]，一些藥物通過TLR4/NF-KB途徑還可發(fā)揮抗炎和保肝作用[24]。而近期的研究揭示，TLR4-MyD88信號傳導(dǎo)途徑可能是通過IRF5調(diào)節(jié)因子在肝臟缺血再灌注損傷中發(fā)揮作用，同時認為，N-乙酰半胱氨酸可以抑制TLR4-IRF5信號通路并因此改善肝損傷[25]。Youn[23]通過將TLR4敲除小鼠與其野生型對應(yīng)物進行對比，發(fā)現(xiàn)IRF3作為TLR4-TRIF信號傳導(dǎo)途徑的下游信號分子，介導(dǎo)了缺血再灌注損傷的發(fā)生。因此，TLR4信號通路的治療干預(yù)可能成為肝切除、失血性休克和肝移植后臨床環(huán)境中預(yù)防肝臟缺血再灌注損傷的有希望的靶標(biāo)。

3.4 肺缺血再灌注損傷 臨床上將肺缺血再灌注導(dǎo)致的肺損傷分為兩種類型，一種是阻斷血液灌注而通氣仍維持時，稱為通氣性缺血；另一種是通氣和血液灌注都被阻斷時，稱為缺氧性缺血。這兩種類型都可引起血管阻力和通透性的升高，從而引起肺水腫和肺動脈高壓。實驗證明，肺缺血再灌注損傷的機理包括氧化應(yīng)激、鈣超載、細胞凋亡、促炎介質(zhì)的釋放、白細胞的激活、鈉泵失活等[26]。

Zanotti等[27]人通過將TLR4缺陷小鼠與TLR4嵌合小鼠進行研究比較，發(fā)現(xiàn)TLR4不僅通過MAPK和NF-KB信號傳導(dǎo)促進炎癥反應(yīng)，而且可介導(dǎo)肺缺血再灌注時的肺水腫。Merry等[28]研究表明，TLR4在肺缺血再灌注損傷的發(fā)展中起關(guān)鍵作用，且在肺泡巨噬細胞的活化中尤為重要。Prakash等[29]研究表明，腸道微生物菌群的減少可以明顯降低體內(nèi)由肺缺血再灌注引起的炎癥反應(yīng)，以及肺泡巨噬細胞對TLR4的反應(yīng)能力。此外，這些數(shù)據(jù)表明通過減少腸道微生物菌群可以減弱肺缺血再灌注損傷。不僅如此，有研究還表明，TLR4可在LPS的激活下促進缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達，上調(diào)炎癥因子水平，進而加重肺缺血再灌注后肺組織的炎癥損傷程度[30]。這些研究都為通過減少TLR4的表達來降低缺血再灌注引起的損傷提供了理論基礎(chǔ)，然而如何真正有效、安全的落實到臨床應(yīng)用上仍需我們進一步研究。

3.5 腸缺血再灌注損傷 與其他器官不同，腸道缺血再灌注損傷更為繁瑣且嚴(yán)重，它不僅有氧化應(yīng)激過程、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡，還可因腸黏膜屏障的破壞導(dǎo)致細菌移位、休克、肺及肝臟等多器官衰竭，死亡率較高[31]。有研究表明，腸道黏膜上的TLR4能夠識別并感知到大量微生物病原體的分子模式，從而介導(dǎo)炎癥，并啟動后續(xù)一連串的免疫反應(yīng)。其中內(nèi)源性配體和外源性配體激活的TLR4被認為是致病菌或創(chuàng)傷性炎癥的主要因素之一，它會導(dǎo)致腸黏膜損傷和屏障破壞[32]。

LPS是TLR4的主要外源性配體，它通過調(diào)節(jié)TLR4信號傳導(dǎo)進行低劑量預(yù)處理，可有效減少腸缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)[32]。TlR4的內(nèi)源性配體HMGB1則經(jīng)過觸發(fā)MyD88和TRIF依賴的下游信號通路，在小鼠腸道缺血再灌注損傷中發(fā)揮關(guān)鍵用途。經(jīng)過實驗研究發(fā)現(xiàn)，抗HMGB1、抗MyD88和抗TRIF抗體的應(yīng)用，都可顯著減少缺血再灌注引起的損傷[33]。因此，近幾年以研發(fā)TLR4為靶點的減緩腸缺血再灌注損傷的藥物為主題的報道層出不窮，如經(jīng)過羅格列酮預(yù)處理后，可以抑制TLR-4/NF-KB信號通路，進而降低炎癥反應(yīng)，減輕腸缺血再灌注損傷[34]。

同時有研究發(fā)現(xiàn)，TLR4參與腸缺血再灌注引起的肺、肝臟、腎等一些遠隔器官的損傷，并在其中起重要作用。然而其具體機理及臨床應(yīng)用價值仍未明確，需要我們進一步的研究。

4 總論

近年來， 隨著人們對TLR4及缺血再灌注損傷研究的不斷加深， 愈來愈多的證據(jù)表明，TLR4與缺血再灌注損傷有著密不可分的關(guān)系。通過對TLR4結(jié)構(gòu)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的了解， 以及TLR4在各器官缺血再灌注損傷的應(yīng)用進展進行總結(jié)，為我們展現(xiàn)了以TLR4為靶點預(yù)防各器官缺血再灌注損傷的可研究性。但是，這些研究還是局限在基礎(chǔ)研究層面，真正能應(yīng)用于臨床的成果卻很少。而且，由于TLR4參與缺血再灌注損傷的功能及機制還不完全清楚，以TLR4 為靶點的治療是否會對正常免疫系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響，需要進一步研究和確認。