王少婷，劉 倩，于 洋，王 艷，曹永彤?

（1.中日友好醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京 100029；2.內(nèi)蒙古包頭市白云鄂博區(qū)婦幼保健院，包頭 014080）

糖基化紅細(xì)胞血紅蛋白 （glycated hemoglobin，GHb）是國際上公認(rèn)的可以反映長期血糖水平的金標(biāo)準(zhǔn)。GHb 由于所結(jié)合的成分不同，又分為HbAla （與磷酰葡萄糖結(jié)合）、HbAl b（與果糖結(jié)合）、HbAlc（與葡萄糖結(jié)合）。糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）在糖尿病管理中是公認(rèn)的血糖控制金標(biāo)準(zhǔn)[1，2]，也是評價(jià)糖尿病治療方案的有效指標(biāo)。目前，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO） 和許多國家的糖尿病學(xué)會已將HbA1c 作為獨(dú)立的糖尿病診斷指標(biāo)[3]。 由于HbA1c 含量最多，臨床上測定的主要是HbAlc[4]。 為避免混淆，國際專家組織建議：GHb 的正規(guī)表達(dá)為HbA1c，在指南或教育資料中可以使用縮寫A1c 描 述HbA1c[5]。

1 HbA1c 在臨床中的應(yīng)用

HbA1c 是人體血液中紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白與血糖結(jié)合的產(chǎn)物，血糖和血紅蛋白的結(jié)合生成HbA1c 是不可逆反應(yīng)，并與血糖濃度成正比，由于紅細(xì)胞的生存周期一般為3～4 個(gè)月，因此通過觀察HbA1c 水平可用于監(jiān)測患者過去120d 內(nèi)總體的血糖控制情況。 且HbA1c 測試不受空腹和胰島素治療的影響。 因此，糖基化紅細(xì)胞血紅蛋白是一種控制糖尿病患者病情的很好的測定指標(biāo)，現(xiàn)在國外已將HbA1c 監(jiān)測作為糖尿病療效判定和調(diào)整治療方案的“金指標(biāo)”[6]，還是WHO 推薦的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。

2010 年，ADA 對國際專家委員會的建議給予了充分肯定，在其《2010 年糖尿病診療指南》及同期發(fā)布的《糖尿病診斷和分布》 中均正式確定將HbA1c 作為糖尿病診斷的一種方法[8]。

GA 是血清白蛋白的非酶糖基化產(chǎn)物，可反映2～3 周的血糖平均水平。 研究表明[9]：糖化白蛋白（glycated albumin，GA） 能客觀的檢測出患者近期血糖的波動情況，具有較好的及時(shí)性和準(zhǔn)確性，GA 在對2 型糖尿病治療效果判斷上優(yōu)先于HbA1c。 雖然GA 可以替代HbA1c 評估平均血糖水平，且檢測方便、快捷，但目前在糖尿病隨診中GA控制標(biāo)準(zhǔn)、GA 對糖尿病并發(fā)癥的預(yù)測價(jià)值等領(lǐng)域尚缺乏類似HbA1c 的臨床研究證據(jù)，GA 的臨床應(yīng)用價(jià)值和HbA1c 比較仍有差距[10]。

HbA1c 作為評價(jià)糖尿病患者長期血糖控制情況及糖尿病并發(fā)癥的重要指標(biāo)，它的檢測方法和試劑廠家繁多，各醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室操作人員水平參差不齊，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室之間檢測結(jié)果偏倚較大。 現(xiàn)將HbA1c 的主要檢測方法、國際標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃的進(jìn)展、 我國HbA1c 參考體系建立的現(xiàn)狀及臨床應(yīng)用進(jìn)行闡述。

2 HBA1c 的檢測方法

目前，HbA1c 的測定方法較多，方法不同監(jiān)測結(jié)果可能會有較大的差異，常用的方法有高效液相法、微柱法離子交換層析、免疫法、電泳法、酶法等。 美國臨床化學(xué)協(xié)會（AACC）HbA1c 標(biāo)準(zhǔn)化分會和IFCC HbA1c 標(biāo)準(zhǔn)化工作組建議，將高效液相法（HPLC）作為檢測HbA1c 的金標(biāo)準(zhǔn)[11]。

2.1 離子交換層析法

其檢測原理是基于GHb 和非GHb 所帶電荷不同進(jìn)行分離。 應(yīng)用弱酸性陽離子交換樹脂，在一定低濃度洗脫液和接近中性pH 條件下，HbA1c 末端纈氨酸糖基化后幾乎不帶正電荷，首先被洗脫。 非糖基化的HbA 帶正電荷，被高濃度洗脫液洗脫。因此可通過此方法將其與其他組分區(qū)分開[12]。此方法血液樣本可用EDTA 和肝磷脂處理[13]。常用的離子交換層析法主要有高效液相色譜法 （HPLC），低效液相色譜法（LPLC）和手工微柱法。 其中高效液相色譜法具有分離效率高、抗干擾能力強(qiáng)的特點(diǎn)，能夠降低血紅蛋白變異體對HbA1c 檢測結(jié)果的干擾。HPLC 法對全血直接測定HbA1c 其批內(nèi)和批間變異系數(shù)CV 均可以<1%（CV<1%），結(jié)果精確。 此方法測定HbA1c 具有操作簡單，快速，準(zhǔn)確的特點(diǎn)，對于長期保存的標(biāo)本依然具有很好的穩(wěn)定性[14]。此方法曾應(yīng)用于美國DCCT 的研究，是目前檢測HbA1c 的金標(biāo)準(zhǔn)。 但環(huán)境溫度、 緩沖液的離子強(qiáng)度和pH對測定結(jié)果影響較大。此方法最大的缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)所用儀器及試劑、耗材昂貴，難以在基層醫(yī)院推廣普及[15]。

2.2 電泳法

電泳法的原理是基于膠體顆粒在一定條件下帶有不同電荷，帶有電荷的膠體顆粒可以借靜電吸引力在電場中泳動。血紅蛋白結(jié)構(gòu)不同，所帶的電荷情況也不同，在瓊脂糖凝膠上的電泳遷移速度也不同，血紅蛋白經(jīng)瓊脂糖電泳后，距離陰極端最近的是含糖基最少的HbAl 和HbAlb，處于中間部分的是HbA1c，距離陽極端最近的是Hb 的主要成分HbA0。 通過光密度儀掃描計(jì)算，最終得HbAlc 的百分含量。 該方法樣本用量少，分辨率高，重復(fù)性較好。 可發(fā)現(xiàn)異常Hb，異常Hb 的存在可使HbA1c 假性增高[16]，但電泳法速度比較慢，自動化程度低，急診插入、自動維護(hù)等功能比較欠缺，無法進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測，目前尚無商品化、具有批量樣本通過能力的儀器面世，因此該法現(xiàn)已少用于臨床，主要用于HbA1c 研究。

2.3 免疫法

免疫法的原理是以血紅蛋白β 鏈N 末端最初的4-8個(gè)氨基酸殘基作為抗體識別位點(diǎn)，制備相應(yīng)的單克隆抗體，HbA1c 與相應(yīng)的單克隆抗體結(jié)合發(fā)生凝集。 其測定方法相對成熟，結(jié)果準(zhǔn)確性好。

2.3.1 離子捕獲法

其原理是GHb 與相應(yīng)抗體結(jié)合后，聯(lián)結(jié)熒光標(biāo)記物，形成反應(yīng)復(fù)合物，再聯(lián)結(jié)帶負(fù)電荷的多聚陰離子復(fù)合物，而在IMX 反應(yīng)孔中的玻璃纖維預(yù)先包被了高分子的四胺合物，使纖維表面帶正電，前述的反應(yīng)復(fù)合物吸附在纖維表面，經(jīng)過一列清洗后測定其熒光強(qiáng)度，從而得到GHb 的濃度，該方法靈敏度和特異性高，重復(fù)性好，自動化程度高，回收率可達(dá)98.85%，交叉污染率低于0.01%，適用于成批GHb 樣本的檢測[17]。但是該方法受樣本濃度影響，高濃度樣本檢測結(jié)果偏低，這與抗體濃度不能達(dá)到相關(guān)高度有關(guān)，需要稀釋；還有HbS、HbC、HbE 和HbF 等變異血紅蛋白可影響檢測結(jié)果。

2.3.2 免疫凝集法

是一種利用HbA1c 與相應(yīng)的單抗結(jié)合進(jìn)而發(fā)生凝集反應(yīng)，通過測定吸光度直接測定總Hb 中HbA1c 百分含量的方法。 該方法不用購置專門的儀器，可在全自動生化分析儀上進(jìn)行測定，因而節(jié)約了實(shí)驗(yàn)室成本，適合于成批的樣本檢測。但該方法易受脂肪血、黃疸等樣本因素影響，抗交叉污染較差，而且要求血紅蛋白在一定范圍之間才能達(dá)到較好的線性。

2.3.3 化學(xué)發(fā)光法

采用離子捕捉免疫分析法，應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)原理，聯(lián)以熒光標(biāo)記物。 通過連接帶負(fù)電的多陰離子復(fù)合物，吸附到帶正電的纖維表面。 經(jīng)過一系列徹底清洗等步驟后，測定熒光強(qiáng)度變化率計(jì)算濃度。該法檢測系統(tǒng)易于規(guī)范和重復(fù)，可減少操作技術(shù)誤差，檢測的靈敏度和特異度高，批內(nèi)、批間變異系數(shù)小，回收率和準(zhǔn)確度高，交叉污染率小，影響因素少，但由于需采購專用試劑包和免疫發(fā)光分析儀成本昂貴，因此僅適用于大批量樣本檢查[18]。

2.3.4 酶法

酶法的原理是變性后的血標(biāo)本經(jīng)蛋白酶消化，糖基化的纈氨酸釋放出來，作為底物果糖纈氨酸氧化酶（FVO）的氧化產(chǎn)生H2O2，H2O2在辣根過氧化物酶的作用下與特定的色原耦聯(lián)[19]。 酶法檢測HbA1c 在低值可檢測范圍比HPLC 法更低，而在高值可檢測范圍也比HPLC 法低。

2.4 床旁檢測（point of care testing，POCT）方法

雖然臨床上使用方便，也成為HbA1c 檢測發(fā)展的重要趨勢，但其分析性能（正確度和精密度）普遍不及實(shí)驗(yàn)室檢測儀器，由于HbA1c 個(gè)體內(nèi)生物變異小，并與糖尿病微血管并發(fā)癥密切相關(guān)，因此測定精密度是評價(jià)儀器性能的關(guān)鍵指標(biāo)之一，也是多數(shù)POCT 儀器HbA1c 測定結(jié)果不能滿足糖尿病診斷和監(jiān)測要求的主要原因[20]。

3 HbA1c 檢測標(biāo)準(zhǔn)化現(xiàn)狀及進(jìn)展

HbA1c 作為糖尿病首選的診斷標(biāo)準(zhǔn)，又是糖尿病篩查以及血糖控制的“金標(biāo)準(zhǔn)”，測定結(jié)果的準(zhǔn)確性直接關(guān)系到糖尿病患者的干預(yù)和血糖控制不同的檢測原理、測定方法可以得到不同的HbA1c 的測定值，加上變異Hb（HbS、HbC、HbE 和HbF）的影響，使得測定結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性以及各實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果有較大差異，根本談不上可比性。而診斷指標(biāo)要用于臨床，首先要可比，而解決可比性的關(guān)鍵在于量值溯源。因此其測定結(jié)果具有溯源性和可比性非常重要。 如何建立一個(gè)國際公認(rèn)的，結(jié)果可以互相比對的HbA1c 分析體系越來越受到臨床重視。

3.1 國際標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程

HbA1c 的標(biāo)準(zhǔn)化工作可以分為兩個(gè)階段：第一個(gè)階段是以美國、瑞典、日本為代表的國家、地區(qū)標(biāo)準(zhǔn)化，第二個(gè)階段是國際臨床化學(xué)與醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)盟（International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）的全球標(biāo)準(zhǔn)化。

為了HbA1c 檢測結(jié)果的一致性，早在1984 年P(guān)etcrson等就首次提出HbA1c 檢測標(biāo)準(zhǔn)化的問題，并對實(shí)驗(yàn)室間不同檢測方法的相關(guān)性和重復(fù)性進(jìn)行了評估。 直到1993年，糖尿病控制與并發(fā)癥試驗(yàn)（Diabetes Control and Complications Trial，DCCT）研究結(jié)果發(fā)表后，美國臨床化學(xué)協(xié)會 （American Association for C1inical Chemistry，AACC）建議所有HbA1c 檢測結(jié)果的單位應(yīng)與DCCT 單位一致，進(jìn)而催生了美國HbA1c 標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃 （National Glycohemoglobin Standardization Program，NGSP），于1996 年完成。NGSP 參考系統(tǒng)是以DCCT 數(shù)值為基礎(chǔ)，把NGSP 參考實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)中各種實(shí)驗(yàn)方法都校準(zhǔn)為DCCT 參考方法，并建議各實(shí)驗(yàn)室只能采用被NGSP 認(rèn)可的方法來檢測HbA1c使臨床實(shí)驗(yàn)室的檢測結(jié)果與DCCT 的檢測結(jié)果更具有相關(guān)性，大大減少了各實(shí)驗(yàn)室之間的差異。

國際上有3 個(gè)HbA1c 國家標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目：美國的國家HbA1c 標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃（National Glycohemoglobin Standardization Program，NGSP），日本糖尿病學(xué)會與日本臨床化學(xué)協(xié)會的聯(lián)合計(jì)劃 （Japanese Diabetes Society/Japanese Society for Clinical Chemistry，JDS/JSCC 以 及 瑞 典 的Mono-S in Sweden 計(jì)劃[21]。 其中最為“著名”的是NGSP。

國際臨床化學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)聯(lián)合會（International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）在1995 年成立了HbA1c 標(biāo)準(zhǔn)化工作組，旨在建立國際公認(rèn)的檢測HbA1c 參考方法和參考物質(zhì)，并于2002 年正式發(fā)表了HbA1c 的參考測定體系，同時(shí)制備HbA1c 和HbA0 的純物質(zhì)參考物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了計(jì)量學(xué)上向國際單位制SI 溯源。 隨后又統(tǒng)一了HbA1c 的命名和單位。 至此，經(jīng)歷了各國的標(biāo)準(zhǔn)化及全球標(biāo)準(zhǔn)化兩個(gè)不可分割的階段，最終實(shí)現(xiàn)了HbA1c 測定的全球可比性。

2003 年，美國99%的實(shí)驗(yàn)室HbA1c 檢測結(jié)果都能溯源到DCCT，ADA 在糖尿病診療指南中推薦HbA1c 作為監(jiān)測血糖控制的“金標(biāo)準(zhǔn)”正是基于此結(jié)果[22]。 2007 年，美國糖尿病組織、歐洲糖尿病研究學(xué)會、國際糖尿病聯(lián)盟和IFCC 等學(xué)術(shù)組織在意大利舉辦了首次HbA1c 檢測標(biāo)準(zhǔn)化共識會議，發(fā)表了“HbA1c 檢測全球化聯(lián)合聲明”，確定了IFCC 的參考系統(tǒng)是唯一能夠滿足標(biāo)準(zhǔn)化要求的方法，并由此衍生出NGSP 單位（%）。 2010 年．再次發(fā)表聯(lián)合聲明：HbA1c 檢測必須在世界范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化，包括參照系統(tǒng)和數(shù)值報(bào)告。

IFCC HbA1c 標(biāo)準(zhǔn)化工作組還組建了參考實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)，截至2014 年10 月底，該網(wǎng)絡(luò)已包括16 個(gè)獲認(rèn)證的參考實(shí)驗(yàn)室和3 個(gè)候選實(shí)驗(yàn)室，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行1～2 種IFCC 參考方法。

3.2 中國HbA1c 標(biāo)準(zhǔn)化的現(xiàn)狀及局限

盡管國際上HbA1c 檢測標(biāo)準(zhǔn)化工作已經(jīng)進(jìn)行了很多年并達(dá)成了共識，但是由于HbA1c 檢測受多種因素影響，我國HbA1c 測定標(biāo)準(zhǔn)化工作仍然處于起步階段，在精密度和準(zhǔn)確性方面與發(fā)達(dá)國家相比仍存在較大的差距，一般CV 仍在7%～10%[23]，與5%的國際標(biāo)準(zhǔn)存在較大差距，這無疑阻礙了HbA1c 作為診斷指標(biāo)應(yīng)用于臨床。

在2011 年之前，由于沒有國家標(biāo)準(zhǔn)，國內(nèi)開展HbA1c實(shí)驗(yàn)室檢測現(xiàn)狀很不理想，各實(shí)驗(yàn)室采用的HbA1c 檢測系統(tǒng)很多，甚至很多實(shí)驗(yàn)室仍在采用非標(biāo)準(zhǔn)化的方法，缺乏相關(guān)的參考實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)及正確性驗(yàn)證的途徑，結(jié)果可比性不容樂觀。 2011 年1 月，由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院潘柏申教授牽頭，與上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院內(nèi)分泌代謝病研究所和上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院糖尿病研究所3 家具有NGSP 資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室共同組織了上海地區(qū)HbA1c一致性計(jì)劃。 這項(xiàng)工作為中國HbA1c 標(biāo)準(zhǔn)化工作提供了寶貴經(jīng)驗(yàn)。

目前在中國，絕大部分醫(yī)院均開展了HbA1c 檢測項(xiàng)目，多種檢測方法在中國均有使用，但不同方法之間的一致性不理想，某些HbA1c 試劑沒有成熟的標(biāo)準(zhǔn)化認(rèn)證，只能取各醫(yī)療機(jī)構(gòu)檢測結(jié)果的平均值作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價(jià)，但納入的實(shí)驗(yàn)室數(shù)量嚴(yán)重影響評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。 但我國對HbA1c檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化的重視正在日益提高，HbA1c 參考體系已基本建立。 2011 年6 月國家食品藥品監(jiān)督管理局組織制定的《HbA1c 分析儀》醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)通過專家二審討論。衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心按照IFCC 參考體系建立了國際公認(rèn)的HbA1c 一級參考方法，并制備了3 個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，參考測量實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可工作也在進(jìn)行中。 該標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布和實(shí)施結(jié)束了我國HbA1c 檢測方法上市不統(tǒng)一，無章可循的狀態(tài)。 NCCL 參考方法于2013 年12 月底通過CNAS ISO 17025 校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室的認(rèn)可。 在2014 年常規(guī)HbA，室間質(zhì)量評價(jià)（external quality assessment，EQA）中，我們采用IFCC 參考方法確定指定值，取代了以往采用組內(nèi)中位數(shù)作為指定值的做法。

2017 年，召開項(xiàng)目啟動會、成立全國HbA1c（HbA1c）專業(yè)委員會，分別在青海省、四川省、江西省、云南省、寧夏自治區(qū)開展省級標(biāo)準(zhǔn)化工作會議；2018 新年伊始省級標(biāo)準(zhǔn)化工作會議在陜西省、廣東省、安徽省陸續(xù)拉開，計(jì)劃全年在全國持續(xù)推進(jìn)，覆蓋約50 個(gè)城市。截止目前已開展的8 個(gè)省份成立了“HbA1c 標(biāo)準(zhǔn)化工作組“，為各省HbA1c 標(biāo)準(zhǔn)化工作奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，隨著項(xiàng)目在全國各地深入開展，將有更多專家、學(xué)者參與其中，將大大加快中國HbA1c標(biāo)準(zhǔn)化工作步伐。

4 展望

從檢驗(yàn)方法方面來說，所有的檢測方法都不是十分完美，都有著自己的缺點(diǎn)，相信隨著對HbAlc 實(shí)驗(yàn)方法不斷改進(jìn)，HbAIc 的更多新的檢測方法可以在臨床上廣泛應(yīng)用，為患者造福。

從標(biāo)準(zhǔn)化角度來講，在我國，整合和開發(fā)現(xiàn)有資源，積極開展HbA1c 測定的一致性和標(biāo)準(zhǔn)化工作，因此在HbA1c 標(biāo)準(zhǔn)化的道路上，仍需加快步伐。相信在各方持續(xù)、有效的共同努力下，將不斷提高HbA1c 的測定質(zhì)量，以適應(yīng)HbA1c 臨床應(yīng)用發(fā)展的需要，更有效地運(yùn)用HbA1c 以推動糖尿病防治工作的發(fā)展，充分發(fā)揮其作用。