郭雪晶 曹赫 周建婭 周建英

目前肺癌在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)發(fā)病率高，且腫瘤相關(guān)死亡率居于第一的特點(diǎn)[1]。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是最常見的組織學(xué)類型，約占肺癌病例的85%[2]。對于早期和一些局部晚期的NSCLC，手術(shù)是最佳的選擇，但是許多患者難以避免術(shù)后的復(fù)發(fā)[3]。以鉑類為基礎(chǔ)的化療是晚期NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)治療，但對生存期的改善有限。過去幾年里，以針對特定基因突變?yōu)橹鞯姆肿影邢蛑委熑〉昧酥卮筮M(jìn)展，卻仍避免不了因獲得性耐藥而導(dǎo)致后續(xù)的腫瘤惡化[4]。

近年來，隨著腫瘤生物學(xué)與免疫學(xué)的交叉滲透，以逆轉(zhuǎn)免疫抑制和重塑腫瘤微環(huán)境為主的免疫治療蓬勃發(fā)展。值得注意的是，在KEYNOTE-010等一系列高質(zhì)量臨床試驗中，程序性死亡因子-1（programmed death 1, PD-1）/程序性死亡因子配體-1（programmed death ligand 1, PD-L1）抑制劑在NSCLC中展現(xiàn)了持久的抗腫瘤效應(yīng)[5-7]。抗PD-1和抗PD-L1單抗價格昂貴且有免疫相關(guān)副反應(yīng)，找準(zhǔn)潛在的獲益人群是關(guān)鍵。國際上有報道的生物標(biāo)志物包括PD-L1、腫瘤突變負(fù)荷、腫瘤浸潤的淋巴細(xì)胞等，而目前有比較明確臨床試驗依據(jù)的是PD-L1的表達(dá)[5,7]。近來關(guān)于PD-L1作為生物標(biāo)志物的檢測方法取得一定進(jìn)展，本文對此作一綜述。

1 PD-L1檢測概述

PD-L1是PD-1最主要的配體，屬B7家族成員，主要以膜性形式（mPD-L1）廣泛存在于腫瘤細(xì)胞和免疫相關(guān)細(xì)胞，部分以可溶性形式（sPD-L1）存在于血液和胸腔積液[8]。PD-1/PD-L1信號通路能誘導(dǎo)與維持外周T細(xì)胞的耐受，是腫瘤免疫逃避的關(guān)鍵分子機(jī)制，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展[9]。PD-L1檢測方法包括免疫組織化學(xué)技術(shù)（immunohistochemistry, IHC）、酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）、定量免疫熒光（immunofluorescence, IF）和流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry, FC）等多種，其中IHC以其高效快速的特點(diǎn)在mPD-L1檢測應(yīng)用最廣泛，而ELISA作為穩(wěn)定便捷的檢測方法在sPD-L1占據(jù)主要地位。

2 IHC

2.1 標(biāo)本來源 目前在免疫治療相關(guān)的臨床試驗中只采用組織學(xué)標(biāo)本進(jìn)行PD-L1的定量檢測。

最近，多項研究證實了細(xì)胞學(xué)標(biāo)本用于PD-L1定量檢測的可行性和有效性。Heymann等[10]的一項評估細(xì)胞學(xué)、小活檢與手術(shù)切除NSCLC標(biāo)本的研究顯示，通過檢測取自188例患者的214個標(biāo)本中PD-L1的表達(dá)量，細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)（包括手術(shù)切除和組織小活檢）標(biāo)本的PD-L1陽性率沒有差異（P=0.083），其中23個有多種標(biāo)本的病人中PD-L1表達(dá)一致者占21個（91%）。Skov等[11]的研究中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在肺組織的同一部位取材獲得86個成對的細(xì)胞學(xué)蠟塊和組織學(xué)標(biāo)本高度相關(guān)（R2=0.87-0.89）。此外，Sakakibara等[12]研究顯示了通過超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下的經(jīng)支氣管針吸活檢（endobronchial ultrasound transbronchial needle aspiration,EBUS-TBNA）獲得的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本兼有高度一致性和微創(chuàng)的優(yōu)點(diǎn)。綜合以上研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在臨床實踐中，尤其對于晚期NSCLC患者和組織學(xué)標(biāo)本獲取困難的情況下，以EBUS-TBNA為代表的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本可以作為新的選擇。但是在其被納入常規(guī)臨床應(yīng)用前，需進(jìn)行嚴(yán)格的大規(guī)模驗證研究和建立一系列細(xì)胞采集的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程。

此外，最新的一項研究提出了循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells, CTCs）作為非侵入性方法可有效檢測晚期NSCLC患者的PD-L1表達(dá)[13]。首先在ISET平臺上富集和分析外周血標(biāo)本的CTCs，再行IHC檢測其表達(dá)。該研究評估了71個配對的肺癌組織和CTCs樣本中PD-L1表達(dá)量，兩者一致性達(dá)93%（CTCs敏感性55%，特異性100%）。這顯示了CTCs在實時監(jiān)測晚期NSCLC患者PD-L1表達(dá)上具有較大潛力。

2.2 標(biāo)本處理 蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性受到多方面的影響，包括缺血時間、固定類型、固定時間、抗原修復(fù)技術(shù)、存儲條件和標(biāo)本存儲時間，故檢測前的標(biāo)本處理至關(guān)重要[14]。標(biāo)本缺血需盡可能短，建議在取材后立即浸入固定液中。而10%中性緩沖福爾馬林溶液因能較好地保存組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和抗原性而成為標(biāo)準(zhǔn)的固定液?；顧z標(biāo)本至少固定5 h，手術(shù)切除標(biāo)本固定24 h-72 h，要控制好固定時間，過度固定也會導(dǎo)致組織中蛋白質(zhì)交聯(lián)而影響免疫組化抗體試劑的滲透[15]。標(biāo)本存儲時間應(yīng)在3年以內(nèi)。研究顯示新鮮的腫瘤標(biāo)本和3年以內(nèi)的存檔標(biāo)本均可用于PD-L1檢測[16]。這意味著對于部分患者可避免再次活檢的風(fēng)險，達(dá)到已獲取的腫瘤標(biāo)本的最大使用。另外，關(guān)于細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的處理標(biāo)準(zhǔn)有待進(jìn)一步優(yōu)化驗證。Lloyd[17]的研究表明Cellient自動化細(xì)胞塊系統(tǒng)可能是PD-L1檢測細(xì)胞學(xué)樣本的首選方法。目前可以接受福爾馬林固定石蠟包埋同時含有足夠腫瘤細(xì)胞（至少50個-100個）的細(xì)胞蠟塊用于檢測[10]。

2.3 檢測抗體 IHC是利用抗原與抗體特異性結(jié)合，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來對組織細(xì)胞抗原進(jìn)行定位、定性及相對定量的方法?，F(xiàn)在已有22C3、28-8、SP142、SP263已經(jīng)獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床。22C3與28-8對應(yīng)Dako診斷平臺，前者的陽性標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定≥1%腫瘤細(xì)胞染色為陽性，≥50%腫瘤細(xì)胞染色為強(qiáng)陽性，后者陽性標(biāo)準(zhǔn)是≥1%腫瘤細(xì)胞染色。而SP142與SP263對應(yīng)Ventana診斷平臺，前者陽性標(biāo)準(zhǔn)是≥10%腫瘤和（或）腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞染色，后者是≥25%腫瘤細(xì)胞染色。此外，還存在實驗室檢測抗體，如E1L3N。

近幾年，國際上對于不同抗體檢測的一致性研究已有不少報道。美國學(xué)者對90例NSCLC手術(shù)切除標(biāo)本分別用22C3、28-8、SP142和E1L3N檢測腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞的PD-L1表達(dá)情況，由13位病理學(xué)家評估染色百分比。結(jié)果顯示，采用SP142抗體在腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞中檢測到的PD-L1明顯減少，不同抗體檢測到的腫瘤細(xì)胞評分的一致性為0.813（95%CI: 0.815-0.839），而免疫細(xì)胞評分的一致性為0.277（95%CI: 0.222 -0.334）[18]。2016年德國進(jìn)行了一項比較22C3、28-8、SP142和SP263在肺腺癌和鱗癌的染色模式研究，在15例手術(shù)切除標(biāo)本的染色中，采用28-8和22C3單抗染色的標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞染色比例相似，相比之下，SP142在4例標(biāo)本中的腫瘤細(xì)胞染色較少，SP263在9例標(biāo)本中顯示了更多的腫瘤細(xì)胞染色比例[19]。2017年同樣評估這4種抗體一致性的藍(lán)印計劃（The Blueprint Project）開展，39例NSCLC標(biāo)本的實驗結(jié)果表明了當(dāng)使用22C3、28-8和SP263分析時，染色的腫瘤細(xì)胞百分比是可比的，而SP142的檢測結(jié)果顯示染色的腫瘤細(xì)胞整體較少[20]。德國一致性研究和藍(lán)印計劃在SP263同22C3、28-8單抗的可比性結(jié)論上有所出入，可能是樣本量過少引起。同年，Ratcliffe等[21]用22C3、28-8和SP263分別檢測500個NSCLC的存檔標(biāo)本，設(shè)定腫瘤細(xì)胞胞膜陽性染色百分比包括1%、10%、25%和50%多個截斷值作為PD-L1陽性標(biāo)準(zhǔn)，不同單抗之間的總體符合率均＞90%。另外，對于以E1L3N為代表的實驗室檢測抗體的爭議仍存在，不同研究闡明的一致性變異大[22,23]，有待日后更多的研究加以改進(jìn)和論證。綜合以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，22C3、28-8和SP263的檢測結(jié)果具有相似的腫瘤細(xì)胞陽性百分比，一致性較高，而SP142染色陽性的腫瘤細(xì)胞較少。由此，我們可以推定22C3、28-8和SP263單抗對腫瘤細(xì)胞的染色結(jié)果具有可交換性，意味著其在未來的臨床應(yīng)用上將有較大潛力。

2.4 檢測結(jié)果判讀 IHC的結(jié)果判讀主要通過人為定性或半定量，有一定的主觀性。所以國際上存在共識，需要設(shè)立專門的實驗室和要求病理學(xué)家具備足夠的經(jīng)驗。尤其目前不同藥物之間截斷值不一，病理學(xué)家們在日常實踐中更應(yīng)該反復(fù)熟悉各種PD-L1截斷值的參考圖像?；谌斯づ凶x的現(xiàn)狀，我國學(xué)者提出應(yīng)用計算機(jī)輔助圖像分析技術(shù)進(jìn)行精確定量的判讀方法[24]。計算機(jī)采集每個切片的5個視野圖像，計算染色程度比值[（棕色區(qū)域面密度/藍(lán)色區(qū)域面密度)×棕色平均光密度]，將空白對照片的比值定義為閾值，與人工判讀（陽性強(qiáng)度×陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)）比較109例肺腺癌中PD-L1的陽性結(jié)果，發(fā)現(xiàn)一致率為88.073%?？梢园l(fā)現(xiàn)，圖像分析技術(shù)和人工判讀的一致性較好，并且前者更具客觀性。

3 ELISA

sPD-L1保留有PD- 1結(jié)合域，故在腫瘤患者體液中具有一定的生物學(xué)活性，盡管在其功能和釋放機(jī)制上仍有爭議之處，但是sPD-L1檢測也可以作為臨床應(yīng)用的一項選擇，尤其對于無法獲得足夠腫瘤標(biāo)本的患者。當(dāng)前，ELISA是最常用的檢測方法。近幾年，隨著對sPD-L1的研究深入及其抗體的制備創(chuàng)新，雙抗體夾心ELISA法取得不少進(jìn)展。2011年我國蘇州大學(xué)經(jīng)過反復(fù)篩選和比較，建立了以鼠單抗2H11為捕獲抗體和以生物素標(biāo)記的10D7為檢測抗體的ELISA檢測體系，檢測范圍為0.195 ng/mL-12.5 ng/mL，R2＞0.99，顯示其具有良好的特異性和穩(wěn)定性[25]。之后國外研究發(fā)現(xiàn)成對小鼠單克隆抗體H1A和B11對人PD-L1細(xì)胞外域有特異性作用，采用H1A作為平板固定捕獲抗體，用生物素化的B11作為檢測抗體[26]。而今年日本的一項研究開發(fā)了新的ELISA檢測系統(tǒng)，PD-1-Ig融合蛋白取代了常規(guī)ELISA中的固定化捕獲抗體。該研究利用配體受體反應(yīng)，能夠定量檢測到具有與PD-1結(jié)合能力的功能性sPD-1。在75例NSCLC患者的血漿樣本檢測中，新的ELISA檢測到sPD-L1陽性者29例（38.6%），平均吸光度是（0.292±0.461），而常規(guī)ELISA檢測到陽性者8例（10.6%），平均吸光度是（0.051±0.027），闡明了新的ELISA靈敏度高于常規(guī)ELISA[27]。

4 其他

近年來IF和FC開始應(yīng)用于PD-L1檢測領(lǐng)域。IF利用抗原抗體特異結(jié)合與熒光素標(biāo)記技術(shù)，由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，人為對抗原進(jìn)行細(xì)胞定位。Velcheti等[28]在多種單抗中篩選出了符合標(biāo)準(zhǔn)的5H1抗體進(jìn)行IF，自動化統(tǒng)計熒光強(qiáng)度，最后以定量IF評分評估NSCLC組織中PD-L1的表達(dá)量。而FC是利用流式細(xì)胞儀對熒光染色單克隆抗體標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)、快速的定量分析技術(shù)，更具客觀性。2017年Caldwell等[29]報道了RK-10多肽在多種腫瘤類型中顯示出與PD-L1結(jié)合的高度特異性和靈敏性，并且對其進(jìn)行熒光素標(biāo)記（RK-10-Cy5），用FC檢測組織、細(xì)胞和血液標(biāo)本中的PD-L1表達(dá)量?，F(xiàn)如今，IF和FC針對PD-L1的特異性抗體研發(fā)后勁不足，制備工藝尚未成熟，因此在PD-L1檢測領(lǐng)域有待進(jìn)一步創(chuàng)新和推廣。

5 PD-L1檢測的臨床價值

5.1 指導(dǎo)治療 分子靶向和免疫抑制在腫瘤治療領(lǐng)域大放異彩，標(biāo)志著腫瘤治療已經(jīng)進(jìn)入精準(zhǔn)醫(yī)療的時代。其中，有效檢測生物標(biāo)志物從而正確選擇獲益人群是精準(zhǔn)治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。大多數(shù)研究證據(jù)表明，PD-L1是用于免疫治療選擇的可靠預(yù)測性生物標(biāo)志物。在POPLAR研究中，對于鉑類化療后進(jìn)展的NSCLC，Atezolizumab以12.6個月的總生存期（overall survival, OS）獲益超越多西他賽，且OS的延長與增加的PD-L1表達(dá)密切相關(guān)，PD-L1表達(dá)陽性的患者OS為15.5個月，明顯高于多西他賽（9.2個月）[30]。類似地，Keynote001[7]和Keynote 010[5]研究也發(fā)現(xiàn)對于PD-L1≥1%的NSCLC患者二線治療選擇pembrolizumab顯著優(yōu)于化療，同時顯示PD-L1≥50%的患者更多臨床獲益，確立根據(jù)PD-L1表達(dá)指導(dǎo)免疫治療的重要價值。另一方面，對于PD-L1檢測陰性的患者，應(yīng)改變治療策略，如聯(lián)合免疫治療[31]。目前PD-L1作為預(yù)測標(biāo)志物具有兩個診斷級別，伴隨診斷指相應(yīng)藥物使用必須進(jìn)行的檢測，補(bǔ)充診斷是非必須的檢測但可提供治療相關(guān)信息。經(jīng)過大量的臨床研究，現(xiàn)已確立PD-L1檢測是Pembrolizumab的伴隨診斷，腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1≥50%的患者一線治療使用Pembrolizumab獲益最大，PD-L1≥1%的患者以其作為二線治療獲益最大。

5.2 預(yù)后判斷 臨床上，肺癌患者的預(yù)后主要依據(jù)TMN分期，病理類型和腫瘤標(biāo)志物等。目前，較多研究發(fā)現(xiàn)sPD-L1高表達(dá)與較差的臨床預(yù)后相關(guān)。有研究評估NSCLC患者組織B7-H1的表達(dá)，結(jié)果顯示B7-H1與腫瘤體積增大、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期的TMN分期高度相關(guān)，并提出B7-H1是不良預(yù)后的獨(dú)立因素[32]。Okuma等[33]進(jìn)一步研究證實經(jīng)ELISA檢測血漿高sPD-L1的肺癌患者OS明顯縮短（13.0個月vs20.4個月，P=0.037）。并且，在接受胸部放療的患者中，經(jīng)ELISA檢測血漿sPD-L1基線水平較低者相比較高者獲得更長的OS獲益（27.8個月vs15.5個月，P=0.005）[34]。而最近一項研究針對肺癌伴惡性胸腔積液的患者，收集積液細(xì)胞蠟塊標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)低免疫細(xì)胞PD-L1表達(dá)往往預(yù)后總生存較差（P=0.004）[35]。我們可以推斷PD-L1的檢測有助于預(yù)后判斷，尤其是以抽取外周血為主的sPD-L1檢測方便易行，有望成為臨床上判斷肺癌預(yù)后的有力工具。

6 小結(jié)

綜上所述，在肺癌免疫研究飛速發(fā)展的今天，PD-L1的檢測方法不斷創(chuàng)新。IHC是當(dāng)今檢測方法主流，用以篩選免疫治療的獲益人群。雖然目前檢測抗體和檢測平臺不一，但各種抗體的一致性檢驗帶給我們信心，22C3、28-8和SP263單抗的檢測結(jié)果具有可交換性，我們可以預(yù)見未來有廣闊的臨床應(yīng)用前景。另外，針對sPD-L1檢測的ELISA是后起之秀，可簡便易行地判斷臨床預(yù)后，但在未來仍需要更多關(guān)于PD-L1作為NSCLC預(yù)后標(biāo)志物的研究。