劉 錚，張義偉，李茜茜，桑曉宇，馮 穎，姜 寧

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866）

馬梨形蟲(chóng)病（equine piroplasmosis，EP）是一種由梨形蟲(chóng)寄生于馬屬動(dòng)物的紅細(xì)胞中，引發(fā)馬屬動(dòng)物發(fā)生一系列臨床癥狀甚至死亡的血液原蟲(chóng)病。本病的主要臨床特點(diǎn)是急性溶血性貧血，其他特點(diǎn)包括高熱、呼吸困難和黃疸等[1-4]。急性感染時(shí)，極易造成感染馬匹死亡。

由于感染該病并治愈的患病馬匹在臨床上具有明顯的帶蟲(chóng)免疫特癥，可在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)出對(duì)馬梨形蟲(chóng)病具有較高的抗性，并且在媒介動(dòng)物再次叮咬后不再表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，因此會(huì)造成馬匹飼主對(duì)該病的忽視。一旦有新出生馬匹或外來(lái)馬匹引入該地區(qū)時(shí)，則極易發(fā)生急性感染，嚴(yán)重時(shí)患畜可能直接死亡，從而對(duì)該產(chǎn)業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。本文對(duì)馬梨形蟲(chóng)病的病原生活史、流行病學(xué)特征、臨床癥狀及診斷方法等方面進(jìn)行了簡(jiǎn)要概述與總結(jié)，以期為馬梨形蟲(chóng)病診斷、流行病學(xué)調(diào)查和預(yù)防布控提供支持。

1 馬梨形蟲(chóng)病概述

馬梨形蟲(chóng)病的病原體包括頂復(fù)亞門（Apicomplexa）孢子蟲(chóng)綱（Sporozoasida）梨形蟲(chóng)亞綱（Piroplasmasina）的巴貝斯蟲(chóng)科（Babesiidae）的駑巴貝斯蟲(chóng)（Babesia caballi，B. caballi）和歸屬于泰勒蟲(chóng)科（Theileriidae）的馬泰勒蟲(chóng)（Theileria equi，T. equi）。這兩種蟲(chóng)體主要靠中間宿主“硬蜱”的叮咬在馬屬動(dòng)物間傳播[5-8]。

1.1 生活史及傳播途徑

梨形蟲(chóng)具有特定的生活史。在自然條件下，梨形蟲(chóng)需要通過(guò)終末宿主硬蜱進(jìn)行傳播，其主要傳播途徑有兩種：其一是利用蜱卵進(jìn)行傳播，梨形蟲(chóng)在雌蜱吸食馬屬動(dòng)物的血液時(shí)進(jìn)入雌蜱的體內(nèi)進(jìn)行繁殖發(fā)育，在繁殖后期進(jìn)入雌蜱的卵巢，通過(guò)蜱卵傳給雌蜱的后代，而后在蜱的后代吸血時(shí)隨著唾液的分泌，進(jìn)入中間宿主馬屬動(dòng)物的體內(nèi)；其二是期間傳播，以T.equi 為代表，當(dāng)幼蜱或若蜱吸食感染T. equi 的馬屬動(dòng)物血液，并長(zhǎng)成為若蜱或成蜱時(shí)，可繼續(xù)通過(guò)吸食馬屬動(dòng)物的血液進(jìn)行傳播[9]。

1.2 流行分布

本病分布范圍廣泛，世界范圍內(nèi)均有報(bào)道。主要分布在熱帶、亞熱帶地區(qū)，巴西、南非、土耳其等國(guó)均出現(xiàn)過(guò)相關(guān)病例[10]；我國(guó)的新疆、吉林、廣東等地也有很多關(guān)于本病的相關(guān)報(bào)道[11-13]。本病流行具有很明顯的季節(jié)性。在我國(guó)，革蜱多于春季2 月大量出現(xiàn)。隨著3 月和4 月氣溫升高，蜱蟲(chóng)的活動(dòng)也開(kāi)始頻繁，馬梨形蟲(chóng)病的病例也逐漸增多，而5 月份之后，隨著蜱蟲(chóng)活動(dòng)能力的下降，馬梨形蟲(chóng)病的流行也漸漸停止[14]。

1.3 易感動(dòng)物及傳染源

馬、驢、斑馬等馬屬動(dòng)物均為馬梨形蟲(chóng)病的易感動(dòng)物，其中幼年動(dòng)物具有較弱的抗性并且缺乏馬梨形蟲(chóng)病的特異性抗體，因此更易受感染。蜱蟲(chóng)作為馬梨形蟲(chóng)病的傳播媒介，在該病的流行中有著十分重要的作用。蜱蟲(chóng)種類眾多并且分布范圍較廣，其中4 個(gè)品種的蜱蟲(chóng)可在馬梨形蟲(chóng)病發(fā)病高峰時(shí)期進(jìn)行傳播，9 個(gè)品種的蜱蟲(chóng)可在排卵時(shí)期傳播B. caballi，9 個(gè)品種的蜱蟲(chóng)可在馬梨形蟲(chóng)病高發(fā)時(shí)期傳播T. equi[15]。

2 馬梨形蟲(chóng)病診斷方法

2.1 病原形態(tài)學(xué)診斷

馬梨形蟲(chóng)寄生于哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞內(nèi)具有多種形態(tài)，如圓形、梨形、棒狀等，同種梨形蟲(chóng)不同形態(tài)的蟲(chóng)體常同時(shí)寄生于同一紅細(xì)胞內(nèi)[16]。但就一種蟲(chóng)體而言，總會(huì)有一種或幾種較為常見(jiàn)的特有形態(tài)，被稱為該蟲(chóng)體的典型形態(tài)。

目前可用于檢測(cè)馬屬動(dòng)物梨形蟲(chóng)病的病原學(xué)診斷方法包括，血液涂片染色鏡檢、淋巴組織穿刺檢測(cè)、淋巴結(jié)組織切片檢查法等[17]。其中，血液涂片染色方法作為檢測(cè)各種血液寄生蟲(chóng)病急性感染最快捷的方法，相對(duì)于其他檢測(cè)手段，在臨床上使用更為廣泛。

雖然本方法在臨床上可以對(duì)急性病例進(jìn)行快速診斷，但在對(duì)大量臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)操作較為困難。同時(shí)，染色劑的質(zhì)量、血液涂片的制作效果等人為因素也會(huì)影響到最終的檢測(cè)效果。因此，在待檢動(dòng)物的染蟲(chóng)率較低時(shí)，本方法診斷準(zhǔn)確性存在明顯不足[18]。

2.2 免疫學(xué)診斷

2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） ELISA 技術(shù)在馬梨形蟲(chóng)的檢測(cè)應(yīng)用中已經(jīng)十分成熟，并且是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的診斷方法之一。如今已經(jīng)有很多可用于ELISA 診斷馬屬動(dòng)物梨形蟲(chóng)病的重組蛋白，其中T. equi 的（EMA-1、EMA-2）和B. caballi（RAP-1、Bc48）均可以在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，并有很好的試驗(yàn)效果。Wang 等[19]從我國(guó)10 個(gè)省份收集1 990 份臨床健康馬的血清，使用間接ELISA 對(duì)重組馬泰勒蟲(chóng)（T. equi）裂殖子抗原2（rEMA-2）和駑巴貝斯蟲(chóng)（B. caballi）48 kDa 棒狀體蛋白（rBc48）進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，B. caballi 和T. equi 感染陽(yáng)性率分別為1 018（51.16%）和229（11.51%），混合感染的樣本數(shù)為152（7.64%）。近年來(lái)，隨著分析技術(shù)不斷進(jìn)步和蛋白質(zhì)組學(xué)等研究的發(fā)展，針對(duì)馬梨形蟲(chóng)病的免疫性抗原蛋白的研究推進(jìn)著該技術(shù)不斷改進(jìn)。該方法在檢測(cè)的靈敏度、特異性、高效性等方面都有很大提高，是目前較為標(biāo)準(zhǔn)的診斷方法。

2.2.2 間接免疫熒光抗體檢測(cè)（IFAT） IFAT 已經(jīng)用于臨床健康的帶蟲(chóng)宿主的診斷。該方法是OIE推薦方法之一，廣泛應(yīng)用于世界各地。Laus 等[20]對(duì)意大利138 只臨床健康的驢采集靜脈血樣，并針對(duì)馬泰勒蟲(chóng)和駑巴貝斯蟲(chóng)，使用IFAT 方法檢測(cè)蟲(chóng)體IgG，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T. equi 和B. caballi 的陽(yáng)性率分別為40.6%和47.8%，并且在19.6%的動(dòng)物中檢測(cè)到雙重陽(yáng)性。該方法已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，具有很好的檢測(cè)準(zhǔn)確性和靈敏性，但其需要標(biāo)準(zhǔn)抗原片及對(duì)照的血清樣本進(jìn)行試驗(yàn)，并對(duì)操作人員和實(shí)驗(yàn)條件需求較高，普遍作為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法。

2.2.3 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT） CFT 曾作為一些國(guó)家用于檢測(cè)馬屬動(dòng)物梨形蟲(chóng)病診斷的主要方法，現(xiàn)在仍被一些地區(qū)廣泛用于馬匹進(jìn)口的檢驗(yàn)。CFT可準(zhǔn)確診斷早期（急性）感染，顯示了其良好的敏感性和特異性，但該方法無(wú)法識(shí)別經(jīng)過(guò)藥物已產(chǎn)生抗補(bǔ)體反應(yīng)的個(gè)體。用于CFT 的抗原是通過(guò)人工感染馬制備的，這引發(fā)了有關(guān)于動(dòng)物福利問(wèn)題的討論。因此，CFT 很可能在未來(lái)停止使用，而IFAT 和c-ELISA 取而代之成為馬屬動(dòng)物梨形蟲(chóng)病在馬匹國(guó)際貿(mào)易上主要的檢測(cè)手段。另外，由于抗體檢測(cè)限和交叉反應(yīng)性，血清學(xué)測(cè)定存在局限性，在某些情況下有誤診的情況發(fā)生。目前該方法逐漸在世界各地停止使用。

2.3 分子生物學(xué)診斷方法

2.3.1 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） PCR 作為一種常規(guī)分子生物學(xué)診斷方法，是診斷馬梨形蟲(chóng)病的常見(jiàn)方法。PCR 方法的靈敏度已經(jīng)顯示出高于顯微檢測(cè)方法的靈敏度。使用PCR 方法檢測(cè)寄生蟲(chóng)DNA具有極高的檢測(cè)敏感性，可檢測(cè)到染蟲(chóng)率為10-8的2.5 μL 血液樣品中的病原DNA，從而檢測(cè)處于低水平寄生蟲(chóng)血癥的持續(xù)感染情況[21]。為了增加PCR 反應(yīng)的靈敏性，科研工作者們?cè)O(shè)計(jì)出了巢式聚合酶鏈反應(yīng)（nested PCR）。巢式PCR 可診斷亞臨床感染，防止受感染動(dòng)物出口，以及確定藥理學(xué)治療的效率。Mahmoud 等[22]使用巢式PCR及IFAT 方法分別對(duì)來(lái)自埃及的88 匹馬和51 頭驢的血液感染情況進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)巢式PCR的陽(yáng)性檢出率（56.8%）高于IFAT（48.9%）。Alhassan 等[23]通過(guò)使用常規(guī)及多重PCR 方法對(duì)49 份蒙古國(guó)的馬樣本進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)了存在蒙古馬感染；分別使用Bc48 和EMA-1 引物，在多重PCR 和常規(guī)PCR 之間取得了完全一致的結(jié)果。PCR 方法可直接對(duì)病原體的核酸進(jìn)行檢測(cè)，具有較強(qiáng)的敏感性；但是在引物設(shè)計(jì)及目標(biāo)核酸的選擇上較為局限，由于引物二聚體等因素的存在，以及在大量實(shí)驗(yàn)樣品的檢測(cè)上需要較長(zhǎng)的準(zhǔn)備及反應(yīng)時(shí)間，因此操作較為復(fù)雜，不適于急性感染的診斷。

2.3.2 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time PCR）與常規(guī)PCR 方法相比，real-time PCR 具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于各種病原體的定性和定量檢測(cè)。該方法是由美國(guó)Applied Biosystems 公司在1996 年推出的定量試驗(yàn)技術(shù)，使用熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，標(biāo)記跟蹤PCR 產(chǎn)物，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程，并結(jié)合相應(yīng)的軟件，分析產(chǎn)物并計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。李佳[24]根據(jù)T. equi 18S rRNA 保守區(qū)域設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物和Taq Man 探針，建立了T. equi 熒光定量PCR 檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，該試驗(yàn)所建立的熒光定量PCR 方法靈敏度可達(dá)1×101拷貝/μL，是普通PCR 的1 000 倍。使用熒光定量PCR 方法進(jìn)行臨床樣本檢測(cè)，并與普通PCR 進(jìn)行檢測(cè)效力比較試驗(yàn)，結(jié)果得出常規(guī)PCR 的陽(yáng)性檢出率為34%，而熒光定量PCR 的檢出率為40 %。Lobanov 等[25]針對(duì)T. equi 的ema-1 基因和B. caballi 的18S rRNA 基因設(shè)計(jì)了一種雙重?zé)晒舛縋CR 檢測(cè)方法，并使用來(lái)自加拿大和美國(guó)的362 份競(jìng)爭(zhēng)cELISA 陰性馬的樣品對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，未發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果。之后使用雙重?zé)晒舛縋CR、單靶熒光定量qPCR及cELISA 三種方法，對(duì)來(lái)自于巴西巴貝斯蟲(chóng)高發(fā)地區(qū)的430 匹未知感染狀態(tài)的馬匹血液樣本進(jìn)行性能評(píng)估測(cè)定試驗(yàn)。結(jié)果證明，三種方法檢測(cè)陽(yáng)性率分別為87.9%，90.5%和87.4%。熒光定量PCR 對(duì)兩種梨形蟲(chóng)物種具有較高的靈敏度。目前，該方法結(jié)合Taq Man 探針可實(shí)現(xiàn)在一次反應(yīng)中檢測(cè)出兩種蟲(chóng)體。因其需要的熒光定量PCR 儀器以及熒光探針的價(jià)格較為昂貴，因此不適于田間檢測(cè)。

2.3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP） LAMP作為一種快速擴(kuò)增技術(shù)，具有敏感、簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)。在疫病檢測(cè)、食品安全、胚胎性別鑒定等方面得到了廣泛的應(yīng)用，而且非常適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[25]。該技術(shù)是由日本學(xué)者Notomi 等建立，克服了PCR 技術(shù)相關(guān)設(shè)備較為昂貴的缺點(diǎn)，并且可以更加直觀地觀察試驗(yàn)結(jié)果，自建立以來(lái)已廣泛應(yīng)用到了各種核酸DNA 的檢測(cè)試驗(yàn)當(dāng)中。謝俊仁[26]通過(guò)分析T. equi 和B. caballi 的18S rRNA 基因序列的差異，分別設(shè)計(jì)了T. equi 和B. caballi 的特異LAMP 引物組，通過(guò)使用不同馬屬動(dòng)物DNA 來(lái)驗(yàn)證所建立方法的特異性，并且通過(guò)多種方法對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明LAMP 方法的敏感性分別相當(dāng)于或高于常規(guī)檢測(cè)方法，可以有效地鑒別T. equi 和B. caballi。雖然該方法可應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，但由于反應(yīng)試劑穩(wěn)定性較差，常出現(xiàn)假陽(yáng)性診斷結(jié)果，仍未能廣泛應(yīng)用于田間檢測(cè)。

3 討論

本文從病原形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)三個(gè)方面對(duì)目前用于馬梨形蟲(chóng)診斷的方法進(jìn)行了簡(jiǎn)要概述。針對(duì)開(kāi)展田間檢測(cè)而言，病原學(xué)形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法仍是在患馬發(fā)病時(shí)使用較多且最為便捷的檢測(cè)方法。但在隱性感染階段及對(duì)馬梨形蟲(chóng)病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查時(shí)，研究人員常選擇從病原形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)三個(gè)方面，通過(guò)多種檢測(cè)方法相結(jié)合的方式來(lái)對(duì)馬梨形蟲(chóng)病感染情況進(jìn)行確認(rèn)。

雖然有大量的檢測(cè)方法可應(yīng)用于馬梨形蟲(chóng)病的檢測(cè)，但需要各種大型儀器作為支撐并且對(duì)操作人員有著較高的技術(shù)要求，而廣泛應(yīng)用于田間檢測(cè)的方法目前仍以染色鏡檢法為主，但該方法在陰性感染階段及染蟲(chóng)率較低的情況下極易造成漏檢。因此，需要一種操作簡(jiǎn)便、診斷準(zhǔn)確、成本低廉的可在田間廣泛推廣的方法。

目前，對(duì)于該病檢測(cè)方法的研究主要側(cè)重在寄生蟲(chóng)免疫學(xué)和分子生物學(xué)研究。免疫學(xué)研究方面更加傾向于對(duì)該病候選抗原蛋白質(zhì)的篩選，特別是對(duì)診斷目標(biāo)蛋白質(zhì)及免疫候選因子的研究。分子生物學(xué)研究方面，數(shù)字PCR、RPA 方法等各項(xiàng)新生檢測(cè)技術(shù)有很好的應(yīng)用前景。其中，RPA 作為一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，靈敏性高，易于操作。另外，RPA 與熒光探針及測(cè)流試紙條相結(jié)合的檢測(cè)方法也廣泛的應(yīng)用于生物樣本的檢測(cè)。該方法在馬梨形蟲(chóng)診斷的應(yīng)用上具備較好的前景，適合在田間推廣使用。此外，得益于國(guó)際社會(huì)一直以來(lái)對(duì)同樣是寄生于紅細(xì)胞內(nèi)的血液原蟲(chóng)病-瘧疾的大量關(guān)注，有很多簡(jiǎn)便快捷的檢測(cè)新技術(shù)值得馬梨形蟲(chóng)病的田間檢測(cè)方法研究借鑒。