饒華春 粘少碩 莊躍玲

（泉州市正骨醫(yī)院，福建 泉州 362000）

維生素D是一固醇類衍生物，由不同的維生素D原經(jīng)過紫外線照射后形成。研究發(fā)現(xiàn)維生素D與人體健康關(guān)系密切，主要參與骨骼效應(yīng)中的鈣磷代謝，具有抗佝僂病的作用[1]；同時還與腫瘤、高血壓、心血管疾病、免疫性疾病、糖尿病、哮喘及感染等疾病相關(guān)[2]。所以了解體內(nèi)維生素D的含量對相關(guān)疾病的診斷非常重要。25-羥基維生素D（25（OH）D）由維生素D通過在肝臟的羥基化作用轉(zhuǎn)化而來，是維生素D在體內(nèi)的主要存在形式。血清內(nèi)25（OH）D的含量高低與體內(nèi)維生素D的儲存水平是相關(guān)的，并可同時反應(yīng)維生素D缺乏的癥狀。因此，現(xiàn)階段臨床上將25（OH）D作為體內(nèi)維生素D含量水平的最佳指標(biāo)。

1 25-羥基維生素D生物學(xué)特征

食物攝取和陽光紫外線照射皮膚是人體補(bǔ)充維生素D的主要方式，該方式和自身合成的維生素D經(jīng)過血液循環(huán)進(jìn)入肝臟，在肝臟羥化酶的羥化作用下形成25（OH）D，隨后25（OH）D與α球蛋白結(jié)合經(jīng)過循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)腎臟并在羧化酶的作用下形成具有活性的1，25-二羥基維生素D。近些年，維生素D的生理意義越來越廣，不僅參與調(diào)節(jié)鈣磷代謝維持鈣、磷的濃度穩(wěn)定，同時還能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞分化等，在諸如心血管疾病、感染性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤、慢性腎病及代謝綜合征等各種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程起著重要的作用。因此體內(nèi)維持維生素D含量的穩(wěn)定非常重要，其含量水平過低或者過高都會引發(fā)不同程度的疾病及相關(guān)癥狀。2010年美國醫(yī)學(xué)科學(xué)院給出指導(dǎo)性意見，推薦血清25（OH）D濃度大于20 ng/mL有利于骨骼健康，大于150 ng/mL可能會引起中毒，不過這種現(xiàn)象較為罕見。據(jù)報道，目前全球缺乏維生素人口超過10億人。

2 25-羥基維生素D檢測方法

現(xiàn)階段血清中25（OH）D的檢測方法眾多，由于25（OH）D的脂溶性以及其他代謝產(chǎn)物的存在使得25（OH）D的準(zhǔn)確檢測較難還沒有形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，按照檢測原理主要有免疫法和色譜法。其中免疫法根據(jù)標(biāo)記技術(shù)的不同又可以分為酶聯(lián)免疫法、放射免疫法、化學(xué)發(fā)光法等；色譜法主要包括高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，大量文獻(xiàn)表明不同的技術(shù)和不同標(biāo)準(zhǔn)操作程序之間存在一定的差異。

2.1 免疫法：免疫法是目前臨床檢測25（OH）D的核心方法，是一種基于抗原抗體特異性結(jié)合的反應(yīng)技術(shù)。1971年第一種被利用于臨床檢測的免疫法是競爭性蛋白結(jié)合法（CPAB），是用人工合成的維生素D與樣本中的維生素D結(jié)合蛋白特異性結(jié)合，進(jìn)而反推出血清中25（OH）D的含量，該方法步驟繁雜、耗費時間，無法滿足臨床高通量、簡便的要求因而逐漸被淘汰。上世紀(jì)八十年代，放射免疫法（RIA）被研究人員關(guān)注，該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)及簡便易行等優(yōu)點一度成為國內(nèi)外檢測25（OH）D的主要方法，90年代進(jìn)一步優(yōu)化，然而RIA由于失蹤同位素的存在對操作人員有一定的放射性使得它不能廣泛的應(yīng)用。隨著技術(shù)的發(fā)展，新的標(biāo)志物和標(biāo)記方法不斷的被發(fā)現(xiàn)利用于臨床診斷，目前國內(nèi)使用較多的免疫法有酶聯(lián)免疫法（ELISA）、化學(xué)發(fā)光免疫法（CLIA）和電化學(xué)發(fā)光免疫法（ECLIA）。ELISA是相對最早利用于臨床的免疫技術(shù)，其采用酶催化反應(yīng)生成有色可溶性物質(zhì)對樣本中成分進(jìn)行標(biāo)記并定量，而CLIA和ECLIA都采用發(fā)光示蹤技術(shù)對靶物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，光電倍增管檢測發(fā)光信號強(qiáng)度回算樣品中25（OH）D的濃度，三種檢測方法各有優(yōu)劣。李光[3]在研究25（OH）D在骨質(zhì)疏松診斷中的應(yīng)用時采用ELISA和CLIA進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示兩種檢測方法相關(guān)性較好（r=0.86，P＜0.05），但ELISA結(jié)果離散程度大且都高于CLIA的結(jié)果，同時ROC曲線分析顯示CLIA法要優(yōu)于ELISA法。武姍姍[4]收集40例臨床血清標(biāo)本檢測25羥基維生素D，用于評價ELISA法和ECLIA法的一致性。兩種方法所得的結(jié)果重復(fù)性及相關(guān)性良好（r=0.994），但兩組結(jié)果的預(yù)期偏差大于預(yù)設(shè)的允許誤差，檢測結(jié)果不一致需按照回歸方程對檢測結(jié)果進(jìn)行調(diào)整后才具有可比性。云春風(fēng)等[5]在參考了NCCLS-EP9-A2文件后對ELISA和CLIA兩種方法用于檢測血清25（OH）D進(jìn)行了相關(guān)性和一致性研究，結(jié)果兩種方法的相關(guān)系數(shù)達(dá)到r=0.981，同時研究發(fā)現(xiàn)隨著樣品濃度的升高，兩種檢測方法結(jié)果之間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差逐漸減小，該研究說明ELISA和CLIA在檢測血清中25（OH）D濃度時相關(guān)性和重復(fù)性都較好。

2.2 色譜法：色譜法基本原理是利用樣品混合物中各組分理化性質(zhì)不同，各組分不同程度的分配到互不相溶的兩相中，當(dāng)兩相進(jìn)行相對運動時各組分在兩相中反復(fù)多次重新分配最終達(dá)到分離的效果。用于血清中25（OH）D檢測的主要是高效液相色譜法（HPLC）和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）。HPLC是較早應(yīng)用的色譜法，與免疫法相比色譜法在特異性、靈敏度和準(zhǔn)確性方面優(yōu)勢明顯并可以同時檢測25-（OH）D3和25-（OH）D2，具有分析速度快、分離效能高、重復(fù)性好、精確度高、節(jié)約成本、可自動化等特點。HPLC的不足之處是檢測設(shè)備非常昂貴，所需樣本量大，樣品的前處理較為復(fù)雜，檢測通量較小，這些因素使該方法只能在一些大型醫(yī)院或高級科研院校才能使用。隨著技術(shù)的發(fā)展HPLC被更加先進(jìn)的LC-MS/MS逐漸代替，目前LC-MS/MS已經(jīng)是檢測25（OH）D最常用的色譜法技術(shù)。LC-MS/MS的檢測器是串聯(lián)質(zhì)譜儀，可以實現(xiàn)分子、離子等2次質(zhì)量的選擇分離，是國際公認(rèn)的檢測金標(biāo)準(zhǔn)。同樣LC-MS/MS具有HPLC相同的缺點限制了它的臨床推廣應(yīng)用。

宋斌斌等[6]建立了LC-MS/MS定量檢測血清25（OH）D的方法，利用Waters的液質(zhì)聯(lián)用儀參照美國食品藥品管理局（FDA）的生物分析方法進(jìn)行驗證，結(jié)果該方法檢測線性范圍為6.25～500 nmol/L，批內(nèi)和批間的變異系數(shù)（CV）分別＜4%和＜6%，完全符合評價標(biāo)準(zhǔn)。韓吉春等[7]以干血點為樣本建立了LC-MS/MS高通量25（OH）D檢測體系，該體系所需樣本量僅約6 μL，整個樣本前處理采用全自動化平臺最終實現(xiàn)高通量。張旋等[8]采用化學(xué)發(fā)光法和LC-MS/MS進(jìn)行性能驗證和評估，兩種方法在靈敏度、精密度和線性范圍等方面符合性均較好。張?zhí)煊潞椭苎┥廩9]對HPLC和ELISA檢測血清25（OH）D3進(jìn)行了對比實驗，結(jié)果兩種檢測方法相關(guān)性良好但不一致，ELISA的檢測結(jié)果需要按照回歸方程調(diào)整后才具有可比性，存在偏差。

3 結(jié) 論

維生素D作為人類重要的營養(yǎng)物質(zhì)與眾多疾病相關(guān)，因此保證其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性對相關(guān)疾病的診療非常重要，LC-MS/MS具有靈敏度和準(zhǔn)確性都較高的特點，是檢測25（OH）D的金標(biāo)準(zhǔn)，但是礙于前期設(shè)備投入大、專業(yè)技術(shù)要求高等原因使得該技術(shù)無法大面積的推廣應(yīng)用，而目前化學(xué)發(fā)光技術(shù)因其自動化及高通量等特點，深受醫(yī)院檢驗人員歡迎。隨著研究的不斷深入及相關(guān)技術(shù)的推廣，未來25（OH）D的檢測方法和儀器主要往用血量少、自動化程度及高通量等方面發(fā)展。