牟燦燦，盧紅梅，陳莉，常冬妹，張麗

（貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽 550025）

薏仁米（Coix lachryma-jobiL.var.ma-yuenStapf），別名川谷、慧苡仁、苡仁米，俗稱“藥王米”、“回回米”等[1,2]，其為禾本科植物薏苡的干燥成熟種仁[3]，是一種藥食同源的優(yōu)質(zhì)禾谷物[4,5]，被譽(yù)為“世界禾本科植物之王”。薏仁米不僅富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉、粗纖維、礦物質(zhì)和維生素等營養(yǎng)成分，還含有酯類、甾醇類、苯并唑酮類、酚類、多糖類和生物堿類等藥效成分[6]。經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，薏仁米具有抗氧化、抗炎癥、抗癌、降血糖和鎮(zhèn)痛止血等生理功效[7～11]。目前，大多數(shù)企業(yè)對薏仁米的加工仍處于粗放型加工模式，整米加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量薏仁碎米，且碎米率高達(dá)30%以上，薏仁碎米與整米的營養(yǎng)價(jià)值相當(dāng)，而價(jià)格僅為整米的 1/6[12～14]。隨著對薏仁米開發(fā)利用的進(jìn)一步研究，將薏仁米豐富的營養(yǎng)成分和藥用價(jià)值引入日常調(diào)味品已成趨勢，旨在為人們提供一款藥食兼用的醬油。

醬油風(fēng)味成分復(fù)雜，種類豐富，主要有醇類、酯類、酚類、羧酸類、羰基化合物和呋喃類等多種成分，其間相互平衡制約、襯托助長，構(gòu)成醬油特有的醬香和酯香[15]。醬油香味與酵母有直接關(guān)系，酵母可利用醬醪中的還原糖進(jìn)行酒精發(fā)酵，發(fā)酵己糖生成醇，從而賦予醬油醇的香氣。在傳統(tǒng)釀造工藝中，酵母主要從環(huán)境中進(jìn)入醬油的后酵體系中參與醬油風(fēng)味物質(zhì)的形成[16]，但其數(shù)量和種類隨季節(jié)與環(huán)境而變，不利于醬油的規(guī)范生產(chǎn)。因此，向醬醪中添加增香酵母已成為提高醬油風(fēng)味的主要手段[17]。增香酵母是一類能合成具有芳香氣味的酯類物質(zhì)[18]，可改善用米曲霉釀造醬油的風(fēng)味單一及不飽和性，全面提高醬油的風(fēng)味及檔次[19～21]。目前，用于提高和加快醬油風(fēng)味成分形成的增香酵母主要有T酵母和S酵母[22]。在醬油釀造過程中添加增香酵母不僅能改善醬油的香味，提高其品質(zhì)，還能在一定程度上縮短醬油釀造所需時(shí)間，有利于控制醬油的釀造進(jìn)程。

在高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中，增香酵母的添加時(shí)期及順序?qū)︶u油風(fēng)味具有重要影響。本試驗(yàn)在薏仁碎米醬醪發(fā)酵過程中在不同時(shí)間和順序添加T酵母和S酵母，并對比分析醬油生香發(fā)酵前后主要的理化指標(biāo)、氨基酸組分及含量、風(fēng)味物質(zhì)成分的變化差異等，旨在為薏仁碎米醬醪增香酵母的添加工藝提供指導(dǎo)，為改善高鹽稀態(tài)薏仁碎米醬油風(fēng)味成分的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

薏仁醬醪，來源于高鹽稀態(tài)發(fā)酵薏仁碎米醬油發(fā)酵過程樣品,（豆粕：薏仁碎米=3：2、米曲霉接種量0.20%、制曲溫度34.5 ℃、制曲時(shí)間49.5 h、每16 h翻曲一次、鹽水濃度為18 °Bé，其添加量為原料的2倍，于 250 mL三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵）；魯氏酵母 AS 2.182，來源于中科院微生物研究所；球擬酵母 AS 2.222，來源于中科院微生物研究所。

1.1.2 主要試劑

重鉻酸鉀，天津市大茂化學(xué)試劑廠；硫酸，天津化學(xué)試劑三廠；硫酸鉀，天津市大茂化學(xué)試劑廠；硫酸銅，天津市北聯(lián)精細(xì)化工開發(fā)有限公司；氫氧化鈉，重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖，天津市協(xié)和昊鵬色譜科技有限公司；乳酸，重慶川江化學(xué)試劑廠；甲醛，成都金山化學(xué)試劑有限公司；硼酸，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司等，以上試劑均為分析純（AR）。

1.2 主要儀器

CJJ-781磁力攪拌器，城西曉陽電子儀器廠；101-1電熱恒溫干燥箱，北京科偉永興儀器有限公司；pHS-3C數(shù)顯酸度儀，上海虹益儀器儀表有限公司；FA2004N電子分析天平，上海菁海儀器有限公司；722S可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；HP6890/5975C GC/MS聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；HH-b型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州奧華儀器有限公司；220V.AC 1000W萬用電爐，天津市泰斯特儀器有限公司等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酵母的添加及發(fā)酵過程管理

將剛制得的高鹽稀態(tài)醬醪進(jìn)行淋油并充分?jǐn)嚢?，以日式高鹽稀態(tài)醬油的發(fā)酵工藝進(jìn)行發(fā)酵，先將其混勻并分裝至9個(gè)容器中，置于15 ℃的生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行醬油前期發(fā)酵，每天攪拌1次至第15 d，按表1添加 2×106個(gè)/g(醬醪)酵母，隨后每天升高發(fā)酵溫度1 ℃，直至30 ℃并保持，持續(xù)發(fā)酵到第45 d；再按表1添加酵母2×106個(gè)/g(醬醪)，以9號樣品為空白對照；發(fā)酵約90 d時(shí)，控制醬醪發(fā)酵溫度于35 ℃到發(fā)酵結(jié)束，整個(gè)發(fā)酵周期為180 d[23]。

醬醪取樣：在無菌條件下將醬醪攪拌均勻，各稱取10.00 g，用100 mL容量瓶定容，靜置過濾，待測。

表1 酵母的添加方式Table 1 The way of yeast addition

1.3.2 醬醪中各理化指標(biāo)的測定

包括總酸、氨基酸態(tài)氮和還原糖含量的測定，測定方法具體參照標(biāo)準(zhǔn)《GB18186-2000釀造醬油》[24]。

1.3.3 氨基酸的測定

采用日立 L-8800氨基酸自動(dòng)分析儀對醬醪中氨基酸進(jìn)行測定，測定過程委托貴州大學(xué)南區(qū)分析測試中心，樣品預(yù)處理采用GB/T 5009.124-2003進(jìn)行處理。儀器進(jìn)樣時(shí)泵1壓力為2～15 Mpa，流速為0.4 mL/min，儀器進(jìn)樣時(shí)泵 2壓力為 0.5～2 MPa，流速為 0.35 mL/min。

1.3.4 揮發(fā)性成分分析

頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）。

1.3.4.1 固相微萃取

取研碎樣品1 g，置于10 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有纖維頭的手動(dòng)進(jìn)樣器，于100 ℃條件下頂空萃取40 min，快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口(溫度250 ℃)中，熱解析5 min進(jìn)樣。

1.3.4.2 氣相條件

毛細(xì)管色譜柱：ZB-5MSI 5%苯基二甲聚硅氧烷毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱溫40 ℃（保留2 min），以5 ℃/min程序升溫至255 ℃，運(yùn)行時(shí)間45 min，汽化室溫度250 ℃，載氣為高純He（99.999%），柱前壓7.62 psi，載氣流量1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣，溶劑延遲時(shí)間為1 min。

1.3.4.3 質(zhì)譜條件

GC-MS接口溫度280 ℃，EI離子源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1624 V，質(zhì)量范圍29～500 u，對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nist 2005和Wiley 275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，初步鑒定出42種揮發(fā)性化學(xué)成分，用峰面積歸一化法測定了各化學(xué)成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用Origin 8.6、Excel 2016等軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，每組進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 還原糖含量

圖1 醬醪中還原糖含量Fig.1 The content of reducing sugar in soy sauce

還原糖含量對醬油風(fēng)味的形成至關(guān)重要，由淀粉質(zhì)原料分解產(chǎn)生，不僅有助于生色，還能被酵母利用生成醇、酸、酯等香氣成分[25]，是評價(jià)醬油品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)。由圖1可知，樣品1～9所含還原糖含量相差甚小，僅樣品7中還原糖含量最高，其含量與空白組相比僅增長了2.8%，結(jié)果表明，添加增香酵母對醬油中所含還原糖含量并無顯著影響。與資料報(bào)道的添加增香酵母僅加速了還原糖的消耗速率，而對發(fā)酵后醬醪中還原糖的含量影響并不明顯[26]一致。

2.2 總酸含量

總酸含量是反映醬油品質(zhì)的主要指標(biāo)之一，各有機(jī)酸與相應(yīng)醇類經(jīng)酯化反應(yīng)可生成具有芳香氣味的各種酯，從而賦予醬油特殊的風(fēng)味[27]，但過高的總酸能使醬油酸味突出，降低醬油的品質(zhì)。《GB2717-2003醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[28]中嚴(yán)格規(guī)定總酸含量不得超過 2.5 g/100 mL，本試驗(yàn)所檢出的總酸含量均在標(biāo)準(zhǔn)限值之下，如圖2。

圖2中，醬油中總酸按含量從多到少進(jìn)行排序分別為在發(fā)酵前后期分別添加兩種增香酵母＞單一添加增香酵母＞不添加增香酵母＞在同一發(fā)酵時(shí)期同時(shí)添加兩種增香酵母，且樣品7中總酸含量最高，比空白組增長了14.63%，在標(biāo)準(zhǔn)限值下對醬油風(fēng)味的形成貢獻(xiàn)最大。

圖2 醬油中總酸含量Fig.2 The content of total acid in soy sauce

2.3 氨基酸態(tài)氮含量

氨基酸態(tài)氮是指以氨基酸形式存在的氮元素含量，主要由游離氨基酸和小分子低聚肽中的氮元素組成[29]，氨基酸態(tài)氮是醬油呈鮮味成分的特征指標(biāo)，其含量高低可表示醬油的鮮味程度，氨基酸態(tài)氮含量越高，蛋白質(zhì)分解越充分，醬油風(fēng)味越好，是評價(jià)釀造醬油品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。如圖3所示，所有樣品中氨基酸態(tài)氮含量高達(dá)0.8 g/100 mL，均達(dá)到國家一級醬油標(biāo)準(zhǔn)。

圖3 醬油中氨基酸態(tài)氮含量Fig.3 The content of amino niteogen in soy sauce

圖3中，樣品1～4、7～8與空白組中氨基酸態(tài)氮含量相近，表明在同等發(fā)酵方式發(fā)酵條件下，添加增香酵母不會(huì)對薏仁碎米醬油中氨基酸態(tài)氮的含量造成很大影響，而同時(shí)添加兩種增香酵母的樣品5、6中氨基酸態(tài)氮含量則明顯低于空白組，分析可能是總酸含量降低所致；由圖3所示，樣品7、8與樣品1～4相比，其氨基酸態(tài)氮含量相對較高，表明分別在不同發(fā)酵時(shí)期添加兩種增香酵母時(shí)氨基酸態(tài)氮含量較高，樣品7中氨基酸態(tài)氮含量高達(dá)0.872 g/100 mL，略高于樣品8，其含量與未添加增香酵母的樣品9相比增長了2.41%，因此，為提高醬油風(fēng)味，樣品7是較好的添加方式。

2.4 酵母的不同添加方式對氨基酸種類以及含量的影響

采用氨基酸自動(dòng)分析儀對添加增香酵母的薏仁碎米醬醪中氨基酸的組成并進(jìn)行定量分析，結(jié)果如表 2所示。

表2 醬醪中氨基酸組成Table 2 Free amino acid composition of soy sauce moromi

氨基酸是醬油中最重要的營養(yǎng)物質(zhì)及質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)，其含量越高，醬油品質(zhì)越高[30]。本試驗(yàn)主要檢出谷氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、脯氨酸、絲氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸等18種氨基酸，賦予了醬油酸、甜、苦、鮮等風(fēng)味，其中呈苦味氨基酸種類占總氨基酸50%，且其含量占總含量 34.32%～40.09%，適量的苦味能賦予醬油更多醇厚風(fēng)味；谷氨酸是醬油鮮味的主要成分，表2中，谷氨酸占總氨基酸含量比例最高，且樣品7中其含量最高，因而對醬油鮮味貢獻(xiàn)最大；由表2可知，酵母的添加均能有效提高醬油中氨基酸含量，其中樣品7中總氨基酸含量高達(dá)13.08 g/100 g，其含量與空白組相比增加了60.88%，且與樣品8相比增加了4.64%。因此，在發(fā)酵第15 d和45 d分別添加T酵母和S酵母能明顯提高醬油中氨基酸的種類和含量，從而提高醬油品質(zhì)。

2.5 酵母的不同添加方式對薏仁碎米醬油揮發(fā)性成分的影響

利用GC-MS對所得醬油的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，其結(jié)果如表3所示。

表3 揮發(fā)性成分的百分含量Table 3 The percentage of volatile components

注：ND表示未檢出。

如表3，已添加增香酵母的樣品7、8均含有42種風(fēng)味成分，其總相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 79.619%和71.75%，而空白組中僅含 33種風(fēng)味成分，且其總相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為 36.063%，表明添加增香酵母不僅能賦予醬油某些特有的風(fēng)味成分，還能提高醬油中某些風(fēng)味成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

酯類化合物是構(gòu)成醬油風(fēng)味的主體物質(zhì)，在醬油中起著香甜、濃郁而柔和的基底作用。如表3所示，本試驗(yàn)共檢出 12種酯類，其中乙酸乙酯所占比例最高，其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)3.359%，具有強(qiáng)烈的水果香氣，能使醬油香味更為醇厚，對醬油的咸味也有一定緩沖作用，還能平衡醬油的風(fēng)味[31]；不同酯類混合能賦予醬油豐厚濃郁的風(fēng)味，如月桂酸乙酯具有花生香味，棕櫚酸乙酯能產(chǎn)生微弱的果香和奶油香氣等，與空白組相比其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大幅度提升，對醬油繁雜的風(fēng)味具有很大貢獻(xiàn)。

醇類化合物在醬油風(fēng)味成分中含量最多[32]，對醬油的香氣貢獻(xiàn)較大。由表3所示，本試驗(yàn)所檢出的醇類化合物有7種，且樣品7中相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，高達(dá)28.73%，以苯乙醇為代表，樣品7中其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)13.954%，明顯高于空白組，苯乙醇具有獨(dú)特的紫羅蘭香、丁香、茴香味、蜂蜜味及青甜玫瑰等多種香氣，是醬油中關(guān)鍵的風(fēng)味化合物，添加增香酵母使其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)大幅度提升，對醬油風(fēng)味的形成具有很大影響；3-甲基丁醇具有蘋果白蘭地的香氣和辛辣味，1-辛烯-3-醇具有愉快的壤香香氣，有類似于甘草、薰衣草及玫瑰的香氣[33]。表3中，3-甲基丁醇、1-辛烯-3-醇及戊醇的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)與空白組相比也顯著增加，賦予了醬油獨(dú)特的風(fēng)味。

醛類具有辛辣刺激氣味，微量的醛對醬油的香氣具有調(diào)和功效，其主要來源于微生物的轉(zhuǎn)化和氨基酸降解[34]，能與酵母代謝產(chǎn)生的醇類或硫化物反應(yīng)，形成新的香氣，使醬油的風(fēng)味更繁雜。表3中，7、8號樣品中檢出6種醛類化合物，其中苯乙醛、3-甲基丁醛和2-甲基丁醛的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯提高，對醬油香氣貢獻(xiàn)很大，且樣品7中相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高；酮類化合物具有果香和甜香的焦糖氣味，如表3，樣品7中苯乙酮相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，且具有令人愉悅的香氣，對醬油特有的風(fēng)味具有一定的貢獻(xiàn)。

醬油中酸類以乙酸為代表，其具有獨(dú)特的香味，能與醬油中醇類發(fā)生酯化反應(yīng)而產(chǎn)生酯類物質(zhì)，增加醬油的酯香味，因此，乙酸對醬油風(fēng)味具有關(guān)鍵作用，表3中，樣品7中乙酸相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.105%。

酚類以4-乙基愈創(chuàng)木酚為代表，其具有典型的醬香和煙熏氣味，其香氣特征明顯，香氣活性強(qiáng)，是提高醬油香氣的關(guān)鍵[35]，雖然檢出的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)很少，但對醬油風(fēng)味的改善具有重大影響。由表3所示，空白組中并未檢出4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，添加增香酵母的樣品7、8中其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高達(dá)0.7%以上，對提高醬油的醬香氣起著舉足輕重的作用。

吡嗪類具有堅(jiān)果和焙烤等香氣，是醬油醬香味的來源。本試驗(yàn)所檢出吡嗪類化合物的相對含量較高，以樣品7最為顯著，以該種方式添加產(chǎn)香對醬油的醬香味貢獻(xiàn)最大。

綜上，添加增香酵母的7、8號樣品中的風(fēng)味物質(zhì)種類和相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯高于空白組，尤其是醇類和酯類，而樣品7風(fēng)味物質(zhì)的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)略高于樣品8，使醬油香氣更繁雜，醬味更突出。因此，以7號樣品添加酵母的方式最為適宜，可改善和提高薏仁碎米醬油的風(fēng)味和品質(zhì)。

3 結(jié)論

為探討增香酵母的不同添加方式對薏仁碎米醬油各指標(biāo)及風(fēng)味的影響，通過對薏仁碎米醬醪中還原糖、總酸、氨基酸態(tài)氮及氨基酸的含量進(jìn)行測定，并采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析了醬油風(fēng)味成分種類及含量。結(jié)果表明：在醬醪發(fā)酵第15 d和45 d分別添加T酵母和S酵母2×106個(gè)/g(醬醪)時(shí)，醬醪中還原糖、總酸、氨基酸態(tài)氮及總氨基酸含量與空白組相比分別增加了2.8%、14.63%、2.41%及37.84%，且醬油中酯類和醇類的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)也顯著提高，與未添加增香酵母的9號空白組相比分別由原來的4.586%和7.120%提高至15.604%和28.733%。表明在高鹽稀態(tài)薏仁碎米醬油發(fā)酵過程中添加增香酵母至關(guān)重要，直接影響醬油中典型風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生及其相互間的協(xié)調(diào)作用，使醬油酯香和醇香濃郁，香氣柔和，極大改善了醬油的風(fēng)味。