馬 濤, 林 娜, 劉小蓓, 張 娜, 張曼玉, 黃夏寧, 溫秀軍

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院, 廣東 廣州 510642)

1 昆蟲性信息素

昆蟲性信息素由昆蟲的特殊腺體分泌,能被同種異性個(gè)體所接受,并引起異性個(gè)體產(chǎn)生一定行為反應(yīng)與生理反應(yīng)(如覓偶、振翅、定向飛行、交配等)的微量化學(xué)信息物質(zhì)(圖1),是保證昆蟲種內(nèi)雌雄個(gè)體之間性的化學(xué)聯(lián)系及有序繁衍的必要基礎(chǔ)。許多昆蟲具有以雌性信息素為主導(dǎo)的化學(xué)通信系統(tǒng),像蛾類主要依靠雌性釋放信息素引誘雄蛾完成交配,而雄性信息素主要是在雄性接近雌蛾時(shí)釋放,誘導(dǎo)雌蟲完成交配[1-2]。

對(duì)于昆蟲性信息素的研究,長期沒有突破性的進(jìn)展,直到1959年Butenandt從50萬頭家蠶(Bombyxmori)雌蛾性信息素腺體中分離得到12 mg性信息素[3],才明確了第一個(gè)昆蟲信息素的化學(xué)結(jié)構(gòu)。由于昆蟲本身釋放信息素較少,且需要蟲口數(shù)量較多,加上當(dāng)時(shí)儀器設(shè)備條件與實(shí)驗(yàn)技術(shù)的限制,嚴(yán)重阻礙了昆蟲性信息素研究的發(fā)展,而對(duì)于昆蟲性信息素的研究,尤以提取獲得性信息素組分和鑒定化學(xué)結(jié)構(gòu)最為重要。因此,筆者根據(jù)自身經(jīng)歷以及前期科學(xué)家的研究,詳細(xì)探索昆蟲性信息素的提取方法和分析技術(shù),旨在為昆蟲性信息素的研究提供技術(shù)參考。

圖1 昆蟲釋放性信息素的過程

2 昆蟲性信息素的提取方法

昆蟲通過腹部末端的特殊腺體組織釋放性信息素,這一過程成為求偶行為,大多數(shù)昆蟲的求偶姿態(tài)為腹部末端上翹(見圖2),準(zhǔn)確獲得昆蟲性信息素活性組分的時(shí)期為求偶時(shí)期。通過采用不同的萃取方法獲得昆蟲性信息素粗提物。

2.1 有機(jī)溶劑浸泡法

采用有機(jī)溶劑浸泡整個(gè)蟲體(較小蟲體)或蟲體有性腺的部位,室溫靜置一段時(shí)間后吸取上清液,過濾處理并轉(zhuǎn)移至另一潔凈色譜瓶中,后用氮?dú)鈱⑵錆饪s到所需要的量再進(jìn)行儀器分析。此方法對(duì)浸泡液的性質(zhì)要求比較嚴(yán)格,溶劑的極性與提取性信息素的極性要相似,同時(shí)溶劑的純度要高。通常會(huì)通過對(duì)溶劑進(jìn)行二次重蒸處理,以確保性信息素能夠全部溶解到溶劑中，并且將雜質(zhì)含量降到最低。目前使用最多的是高效色譜純正己烷,使用前將正己烷(HPLC)二次重蒸處理。此外,庚烷、二氯甲烷、丙酮、二甲苯等溶劑也是常用于提取昆蟲性信息素[4-6]。

2.2 冷凝法

將凈化的空氣通入裝有活蟲的容器中,雌蟲或雄蟲分泌的性信息素隨空氣排出,在低溫下冷凝收集。常用的冷凝材料有酒精-干冰和液態(tài)氮,該方法雖簡單,但是昆蟲信息素釋放量較少,加上超低濃度的信息素在低溫下不能產(chǎn)生霧滴,收集效果相對(duì)較差。有人用這個(gè)方法收集了12.2 mg的美洲蜚蠊性信息素[7]。

2.3 動(dòng)態(tài)頂空吸附法

利用氣固吸附原理,采取高效吸附劑將空氣流中的性信息素分子吸附,隨后再用溶劑洗脫。具體操作：將昆蟲放入容器中,容器密閉,出口處連接吸附管,用真空泵抽走內(nèi)部的空氣,從入口處泵入經(jīng)活性炭過濾的干凈空氣,帶出容器內(nèi)的揮發(fā)性成分,揮發(fā)性成分在出口處被吸附管吸附。一般活性炭前需連接加濕器,防止昆蟲因缺水而死亡。將吸附管用合適的有機(jī)溶劑進(jìn)行洗脫、濃縮。常見的吸附劑主要是Porapak Q(乙基乙烯基苯-二乙烯基苯共聚物),Super Q,Tenax(2, 6-二苯基對(duì)氧化次苯醚),XAD(二乙烯基苯/苯乙烯共聚物)。此方法的優(yōu)點(diǎn)是能夠采集活體昆蟲的揮發(fā)物,并可對(duì)微量的化合物進(jìn)行定性和定量的分析,測定結(jié)果能真實(shí)地反映被測昆蟲所釋放的化學(xué)組分及其比例,攜帶方便,適合野外操作；缺點(diǎn)是收集量少。對(duì)于像雙翅目、同翅目等體型較小的昆蟲性信息素的研究,這種方法的優(yōu)越性非常明顯[8]。

2.4 固相微萃取法

固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)是一種新興的提取昆蟲性信息素的方法。其原理：用一根熔融的石英纖維,它的表層涂有特異性涂層,由于揮發(fā)物質(zhì)的極性和官能團(tuán)差異,需選擇合適的纖維頭,常見的纖維頭主要有聚二甲硅烷(PDMS)、聚丙烯酸酯(Polyacrylate)、聚二甲硅烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)、聚二甲硅烷/碳分子篩(PDMS/CMS)、二乙烯基苯/碳分子篩(DVB/CMS)；在提取過程中,纖維頭被手柄推出保護(hù)針,將性信息素吸附在表面；然后將石英纖維直接注入氣相色譜(GC)的進(jìn)樣口,吸附在其表面的揮發(fā)物在瞬時(shí)高溫條件下解吸附,進(jìn)入色譜柱分離。這種方法有如下優(yōu)點(diǎn)：不需要溶劑,鑒定時(shí)無溶劑的干擾與污染；提取成本低,少量蟲源即可達(dá)到理想的效果,樣品分析快，操作簡單方便。該方法也有明顯的缺點(diǎn)：吸附劑纖維需在頂空氣體中停留的時(shí)間要足夠長,化學(xué)物質(zhì)的揮發(fā)程度與時(shí)間長短成反比；化學(xué)物質(zhì)的揮發(fā)性依分子大小、極性和官能團(tuán)不同而異,須選擇合適的吸附劑；溫度影響吸附劑對(duì)揮發(fā)物的吸收；昆蟲性信息素釋放量甚微,且屬于有活體的生物,所以SPME還受到纖維頭是否在昆蟲釋放性信息素之前達(dá)到飽和狀態(tài)有關(guān)；萃取后沒有樣品,僅僅只能做1次分析[9]。

3 昆蟲性信息素的結(jié)構(gòu)鑒定

現(xiàn)在，由于毛細(xì)管氣相色譜(GC)、觸角電位儀(EAG)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)、氣相色譜-觸角電位聯(lián)用(GC-EAD)、高壓液相色譜(HPLC)等高效微量分析儀器的應(yīng)用和分離提取技術(shù)的發(fā)展,進(jìn)行昆蟲性信息素化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定所需的昆蟲已從數(shù)十萬頭減少到幾百頭,幾十頭,而且縮短了研究周期,提高了工作效率。

應(yīng)用EAG和GC-EAD分析方法對(duì)收集的性信息素進(jìn)行分析測定,可以通過昆蟲嗅覺感器對(duì)化合物進(jìn)行識(shí)別,檢測出活性成分；根據(jù)EAG反應(yīng)和GC保留時(shí)間與Kovats指數(shù)測定結(jié)果,初步分析判定性信息素組分活性強(qiáng)度、含量及其比例；利用GC-EAD、GC-MS相結(jié)合,輔以微量化學(xué)反應(yīng)方法,確定活性化合物結(jié)構(gòu),并以確定的活性化合物為標(biāo)樣(向試劑公司訂購或項(xiàng)目組自己合成),以性信息素提取物為對(duì)照,進(jìn)行GC-EAD和GC-MS分析,并輔以Kovats指數(shù)測定方法,進(jìn)行性信息素成分鑒定(見圖3)[10-12]。此外,可以采用GC-SCR(氣相-單細(xì)胞記錄儀聯(lián)用)技術(shù),通過記錄雄觸角上的單細(xì)胞化學(xué)感受器對(duì)候選化合物的電生理反應(yīng),測定出具有活性的化合物。

對(duì)于一些性信息素釋放量較少的昆蟲,可利用MEMS-GC-EAD(2017年12月剛報(bào)道的一種新型裝置)篩選引起觸角反應(yīng)的活性化合物；同時(shí)可采用GC×GC/TOFMS(全二位氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀)測定其化學(xué)結(jié)構(gòu),它是20世紀(jì)90年代誕生的多維色譜分離技術(shù),是把分離機(jī)制不同而又相互獨(dú)立的兩根色譜柱以串聯(lián)方式連接在一起的二維系統(tǒng),而飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOFMS)目前是唯一可以與GC×GC很好匹配的質(zhì)譜技術(shù),二者的靈敏度均可達(dá)到1pg[13-14]。

圖3 昆蟲性信息素組分的GC-EAD和GC-MS分析

在已鑒定出來的昆蟲性信息素中,鱗翅目昆蟲占大多數(shù),這些性信息素在結(jié)構(gòu)上往往具有雙鍵結(jié)構(gòu),但GC-MS和GC×GC/TOFMS并不能確定性信息素組分的立體構(gòu)型(不同構(gòu)象的化合物可能具有相同的保留時(shí)間),質(zhì)譜檢測器僅能給出性信息素組分的大致結(jié)構(gòu),像分子量、官能團(tuán)、雙鍵個(gè)數(shù)等,但不能完全確定雙鍵的位置、順反異構(gòu)[15]。因此,可利用微量化學(xué)反應(yīng)及其他化學(xué)分析手段確定性信息素結(jié)構(gòu),例如單個(gè)雙鍵的性信息素化合物,用DMDS(二甲基二硫醚)與化合物的CC發(fā)生衍生反應(yīng),然后將衍生產(chǎn)物經(jīng)GC-MS分析,確定雙鍵的位置。該方法的優(yōu)點(diǎn)是順式及反式不飽和化合物的DMDS衍生物質(zhì)譜圖雖相同,但保留時(shí)間不同,非極性色譜柱上的順式結(jié)構(gòu)化合物的衍生物的出峰時(shí)間早于反式化合物；共軛雙鍵的性信息素化合物,可用MTAD(4-甲基-1,2,4-三哩啉-3,5-二酮)與化合物的共軛CC發(fā)生Diels-Alder加成反應(yīng),判斷雙鍵的位置,該方法生成的衍生物比較穩(wěn)定,分子峰M+清晰,而且MTAD常溫條件下與共軛二烯化合物的反應(yīng)迅速,親和力強(qiáng)。乙酸酯親和力>醇類親和力>醛類親和力；以上方法都需要一定量的性信息素粗提物,而對(duì)于性信息素釋放量甚微的昆蟲而言,十分不便。

4 展望

目前,國內(nèi)外對(duì)利用昆蟲本身的生理特性及行為特點(diǎn)作為防控害蟲的新型技術(shù)日益受到重視,其中以昆蟲性信息素技術(shù)研究尤為突出。目前大多數(shù)昆蟲的性信息素活性組分已經(jīng)得到鑒定,進(jìn)而大范圍市場化,但是仍舊有一些重要昆蟲性信息素研究沒有任何進(jìn)展,或者僅僅只有室內(nèi)的電生理反應(yīng)或者行為測試,這可能與昆蟲蟲體的發(fā)育狀態(tài)、性信息素生物合成等因素有關(guān)。此外,部分昆蟲的性信息素釋放量更少,現(xiàn)有的分析儀器可能也無法檢測到[16]。因此，需要在原有提取和分析性信息素組分的基礎(chǔ)上,更加深入地探索昆蟲性信息素的提取方法和分析鑒定技術(shù),為更好地開展昆蟲性信息素組分的研究提供技術(shù)參考。