張媛 徐紅

[摘要] 目的 探討復(fù)方芪苓配方顆粒治療高尿酸血癥大鼠的作用機(jī)制。 方法 通過腺嘌呤灌胃及氧嗪酸鉀皮下注射建立高尿酸血癥模型，連續(xù)給藥14 d。分別測(cè)定血清尿酸（UA）、肌酐（Scr）、尿素（Urea）及膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-c）和低密度脂蛋白（LDL-c）水平;采用RT-PCR方法分別測(cè)定大鼠腎臟中相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)水平。 結(jié)果 與模型對(duì)照組比較，復(fù)方芪苓配方顆粒能顯著降低高尿酸血癥大鼠血清UA、Scr、Urea、TC、LDL-c水平，同時(shí)可以顯著下調(diào)腎臟尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體（URAT1）mRNA的表達(dá)，上調(diào)有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1（OAT1）、有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體2（OCT2）mRNA的表達(dá)。 結(jié)論 復(fù)方芪苓配方顆粒能改善高尿酸血癥大鼠的腎功能、血脂代謝，其作用機(jī)制可能是下調(diào)大鼠腎臟中URAT1 mRNA的水平，上調(diào)OAT1和OCT2 mRNA的水平，從而降低腎臟尿酸鹽重吸收能力及增加尿酸鹽的分泌。

[關(guān)鍵詞] 復(fù)方芪苓配方顆粒;高尿酸血癥;腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)體;大鼠

[中圖分類號(hào)] R285.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）33-0008-04

[Abstract] Objective To explore the mechanism of action of compound Qiling formula granules in treating rats with hyperuricemia. Methods The hyperuricemia model was established in rats by adenine gavage and hypodermic injection of oxonic acid potassium salt. The drug was administered continuously for 14 days. The levels of serum uric acid（UA）， creatinine（Scr）， Urea， total cholesterol（TC）， triglyceride（TG）， high-density lipoprotein-cholesterol（HDL-c）， and low-density lipoprotein-cholesterol（LDL-c） were tested respectively.? RT-PCR was used to measure the expression levels of related renal transporters of the subjects. Results Compared with the model control group， the levels of serum UA， Scr， Urea， TC， LDL-c of rats with hyperuricemia were significantly lowered by applying compound Qiling formula granules. The expression level of the mRNA of the urate reabsorption transporter-1（URAT1） was down-regulated significantly， and the expression levels of the mRNA of organic anion transporter-1（OAT1） and organic cation transporter-2（OCT2） were up-regulated significantly. Conclusion Compound Qiling formula granule can improve the renal function and lipid metabolism of rats with hyperuricemia. Its mechanism may be related to the down-regulation of the level of URAT1 mRNA， and the up-regulation of the levels of OAT1 and OCT2 mRNA in the kidney of the rats， both of which can reduce the reabsorption capacity of urate in the kidney and increase the secretion of urate.

[Key words] Compound Qiling formula granules; Hyperuricemia; Renal transporter; Rats

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展及人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，高尿酸血癥的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，且發(fā)病年齡逐漸年輕化[1-3]。高尿酸血癥可誘導(dǎo)痛風(fēng)、腎結(jié)石及加速腎臟和心血管疾病的進(jìn)程[4-5]，因此對(duì)于高尿酸血癥早發(fā)現(xiàn)、早治療就尤為重要。西藥在治療高尿酸血癥上雖有確切的降尿酸作用，但停藥后復(fù)發(fā)率較高，且不良反應(yīng)較多，部分藥物在一定程度上有加重腎損害的風(fēng)險(xiǎn)[6]。隨著中醫(yī)藥對(duì)高尿酸血癥研究的不斷深入，多個(gè)研究證明許多中藥具有降低血尿酸的功效[7-8]，且中藥復(fù)方制劑具有增效減毒的優(yōu)勢(shì)，因此，開發(fā)研究降低尿酸的中藥復(fù)方制劑具有重大意義和廣闊前景。

復(fù)方芪苓配方顆粒（原名：尿酸利仙配方顆粒）為徐紅教授臨床驗(yàn)方，已有多年臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，由山慈菇、土茯苓、桑寄生、丹參、黃芪、秦艽、薏苡仁等組方而成，具有健脾益氣、化瘀泄?jié)?、清熱利濕的功能。本課題組前期臨床研究證實(shí)本方能有效降低患者血尿酸水平，且無明顯不良反應(yīng)[9]。本研究擬通過復(fù)方芪苓配方顆粒對(duì)高尿酸血癥大鼠的實(shí)驗(yàn)研究，觀察其對(duì)調(diào)節(jié)腎功能、血脂代謝、腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)體方面的影響，進(jìn)而為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 主要試劑與儀器? 氧嗪酸鉀（日本TCI公司，批號(hào)：2207-75-2）;腺嘌呤（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：73-24-5）;戊巴比妥（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：57-33-0）;中藥復(fù)方芪苓配方顆粒（杭州市中醫(yī)院制劑室提供）;別嘌呤醇片（上海信誼萬象藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H31020334，規(guī)格：100 mg/片）;尿酸、肌酐、血脂測(cè)定試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號(hào)：160551）;引物合成（由杭州嘉朗生物技術(shù)有限公司提供）。日立7180型全自動(dòng)生化分析儀、OLYMPUS CH30顯微鏡。

1.1.2 動(dòng)物? 清潔級(jí)SD雄性健康大鼠60只，10周齡，體質(zhì)量（150±20）g左右，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心全屏障清潔級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2013-0184。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與造模? 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，稱重并隨機(jī)分成正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、治療組（高、中、低劑量復(fù)方芪苓配方顆粒）及陽性對(duì)照組（別嘌呤醇）等六組，每組10只。除正常對(duì)照組實(shí)驗(yàn)過程中普通飼料飼養(yǎng)外，其余5組以10%的酵母粉飼料飼喂，并上午給予100 mg/kg腺嘌呤灌胃，并以100 mg/（kg·d）氧嗪酸鉀分2次腹部皮下注射，連續(xù)造模14 d。各治療組大鼠在造模后同時(shí)分別每天下午灌胃給予復(fù)方芪苓配方顆粒，其中高劑量組為9.6 g/kg;中劑量組為4.8 g/kg;低劑量組為2.4 g/kg;陽性對(duì)照組給予別嘌呤醇10 mg/kg，正常對(duì)照組及模型對(duì)照組給予蒸餾水灌胃，連續(xù)給藥14 d。所有動(dòng)物給藥體積均為20 mL/kg。

1.2.2 取材? 末次給藥后，次日稱重后腹腔注射戊二醛麻醉，從大鼠腹主動(dòng)脈采血（取血前12 h斷糧），離心機(jī)10000 r/min離心5 min分離血清，將血清置于4℃保存，用于生化指標(biāo)測(cè)定。然后在冰臺(tái)上快速分取腎臟組織，去除膜和髓質(zhì)，置于-80℃條件冰箱保存，用于RT-PCR分析。

1.2.3 大鼠腎功能及血脂代謝檢測(cè)? 分別取各組血清采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清尿酸（UA）、肌酐（Scr）、尿素（Urea）及膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-c）及低密度脂蛋白（LDL-c）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊者組間比較用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者用Games-Howell檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方芪苓配方顆粒對(duì)高尿酸血癥大鼠血清尿酸、肌酐、尿素的影響

與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組血清尿酸、肌酐、尿素水平明顯升高（P<0.01）。與模型對(duì)照組相比，別嘌呤醇組血清尿酸明顯降低（P<0.01），肌酐有一定程度降低（P<0.05）。復(fù)方芪苓配方顆粒各劑量組均可有效降低模型組動(dòng)物的血清尿酸（P<0.01），且中藥劑量越大，降低越明顯。復(fù)方芪苓配方顆粒高、中劑量組血清肌酐和尿素均有顯著降低（P<0.01），低劑量組血清肌酐有一定程度降低（P<0.05），見表1。

2.2 復(fù)方芪苓配方顆粒對(duì)高尿酸血癥大鼠血脂代謝的影響

與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組血清膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平明顯升高（P<0.01），高密度脂蛋白水平明顯降低（P<0.01）。與模型對(duì)照組相比，別嘌呤醇組未見明顯改變（P>0.05）。復(fù)方芪苓配方顆粒各劑量組均可有效降低模型組動(dòng)物的血清膽固醇、低密度脂蛋白水平（P<0.05，P<0.01）。與別嘌呤醇組比較，復(fù)方芪苓配方顆粒高、中劑量組血清膽固醇、低密度脂蛋白均有明顯降低（P<0.05），見表2。

3討論

高尿酸血癥是嘌呤代謝紊亂所致細(xì)胞外液的尿酸鹽呈超飽和的狀態(tài)，而正常人體內(nèi)尿酸鹽的2/3由腎臟排泄[10]。一旦腎功能受損，則尿酸鹽排泄出現(xiàn)異常，故而造成尿酸鹽在體內(nèi)蓄積的同時(shí)又可導(dǎo)致或者加重腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展。慢性尿酸性腎病是高尿酸血癥腎臟損害的最常見類型，臨床中常伴有腎功能改變及血脂代謝紊亂，具有明顯的腎間質(zhì)損害[11]。

由于腎臟在尿酸的排泄過程中對(duì)維持血尿酸水平起著主導(dǎo)作用，深入研究腎臟排泄尿酸的機(jī)制越來越重要。近年來，研究發(fā)現(xiàn)腎臟排泄尿酸的過程與腎臟中的多種尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白密切相關(guān)，血液尿酸經(jīng)過腎小球?yàn)V過進(jìn)入腎小管，主要經(jīng)過重吸收蛋白URAT1重吸收入血[12]，由分泌蛋白OAT1重新分泌入尿，最終排出體外。Hosoyamada等[13]通過敲除小鼠URAT1基因的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)其尿中尿酸鹽高于正常小鼠，證明URAT1能夠減弱尿酸鹽的重吸收作用，從而促進(jìn)尿酸排泄增多。OAT1在腎臟中表達(dá)下調(diào)可減少腎臟有機(jī)陰離子的分泌，而尿酸是主要在腎小管中通過OAT1轉(zhuǎn)運(yùn)的一種內(nèi)源性有機(jī)陰離子[14-15]。OCT2在腎臟中介導(dǎo)多種有機(jī)陽離子的吸收與重吸收[16-17]。

高尿酸血癥在中醫(yī)學(xué)無相應(yīng)的病證名，大多學(xué)者認(rèn)為屬濕濁、瘀血范疇，其病因病機(jī)在于先天不足或后天失養(yǎng)，復(fù)加過食肥甘厚膩而致脾失健運(yùn)、痰濕內(nèi)生，濕邪彌散于營(yíng)血、氣失宣暢，血行瘀滯，郁久則濕瘀蘊(yùn)阻[18-20]，故本病屬本虛標(biāo)實(shí)之證，治宜標(biāo)本兼顧。復(fù)方芪苓配方顆粒方中土茯苓解毒除濕、通利關(guān)節(jié)，山慈菇清熱解毒、消癰散結(jié)，薏苡仁淡滲利濕，秦艽清熱利濕，配以丹參活血化瘀通絡(luò)，桑寄生除濕通絡(luò)、補(bǔ)腎固本，黃芪益氣利尿，防上述祛濕化瘀藥攻伐太過，諸藥合用，共奏健脾益氣、化瘀泄?jié)?、清熱利濕之效?/p>

本研究通過對(duì)大鼠用腺嘌呤聯(lián)合氧嗪酸鉀誘導(dǎo)，加上酵母粉高嘌呤飲食，共同作用造成穩(wěn)定的與人高尿酸血癥相似機(jī)制的模型。這一模型的建立，為研究中藥復(fù)方制劑治療高尿酸血癥提供了很好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，復(fù)方芪苓配方顆粒各劑量組均可有效降低模型組動(dòng)物的血清尿酸，且中藥劑量越大，降低越明顯。復(fù)方芪苓配方顆粒高、中劑量組血清肌酐、尿素、膽固醇、低密度脂蛋白均有顯著降低，證明復(fù)方芪苓配方顆粒能顯著改善高尿酸血癥大鼠的腎功能、降低尿酸，改善脂質(zhì)代謝紊亂。同時(shí)，與模型對(duì)照組比較復(fù)方芪苓配方顆粒高、中劑量組URAT1 mRNA表達(dá)顯著下降、OCT2 mRNA表達(dá)顯著升高，復(fù)方芪苓配方顆粒高劑量組OAT1 mRNA表達(dá)顯著上升，表明復(fù)方芪苓配方顆粒有抑制高尿酸血癥大鼠腎臟對(duì)尿酸的重吸收并具有促進(jìn)尿酸分泌的作用。

綜上所述，復(fù)方芪苓配方顆粒能顯著改善高尿酸血癥大鼠的腎功能、降低血尿酸，改善血脂代謝，下調(diào)高尿酸血癥大鼠腎臟URAT1水平及上調(diào)OAT1、OCT2水平的表達(dá)，提示其具有明顯的降尿酸作用，同時(shí)血尿酸降低到正常和接近正常水平能緩解高尿酸血癥引起的脂質(zhì)代謝紊亂，具有較好的腎臟保護(hù)作用。其降尿酸的作用機(jī)制可能與通過對(duì)腎臟尿酸相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體的調(diào)節(jié)作用、降低腎臟尿酸鹽重吸收能力及增加尿酸鹽的分泌有關(guān)。這為復(fù)方芪苓配方顆粒作用于高尿酸血癥的研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2019-08-02）