龍艷珍，吳菲菲，2，李化強，2，*，趙良忠，2

（1.邵陽學院食品與化學工程學院，湖南邵陽422000；2.湖南省果蔬清潔加工工程技術研究中心，湖南邵陽422000）

酶法加工已遍布各行各業(yè)，而在果蔬加工中主要應用到的許多重要酶制劑，如果膠酶、纖維素酶等都依賴進口，進口意味著果蔬加工生產(chǎn)成本高，行業(yè)發(fā)展受到嚴重限制，而棘孢木霉（Trichoderma asperelham）發(fā)酵可產(chǎn)生一系列對細胞壁具有水解作用的水解酶，如纖維素酶、果膠酯酶、果膠裂解酶等[1]，另外，棘孢木霉菌株還可應用于生物防治方面[2-4]，且效果良好。在團隊前期的研究中發(fā)現(xiàn)，所篩選出的棘孢木霉菌株發(fā)酵液[5]具有降解柑橘白皮層和囊衣的作用且降解效果較好，這與前人對棘孢木霉菌株產(chǎn)纖維素酶、半纖維素酶、N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶、幾丁質(zhì)酶、果膠酶等[6-9]的研究一致。另外，在將棘孢木霉應用到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的過程中發(fā)現(xiàn)，菌株的貯藏、活化、制備及運輸，都存在諸多問題，如活化時間長、貯藏條件要求高、需要冷鏈運輸?shù)惹闆r。綜上，采用真空冷凍干燥技術對菌株進行凍干處理，以便保藏及應用。

常見且易于實現(xiàn)的菌種保藏法為甘油法[10-11]，其操作相對比較簡單，適用范圍廣[12]，但需要低溫冰箱常年冷凍且菌種的保藏期限不確定。真空冷凍干燥技術是既能完成凍干任務又能很好的保護目標物活性的一種技術[13]。在九十多年的研究中，真空冷凍干燥技術的應用潛力被大量的開發(fā)，其中有人用于研究菌種的保藏[14-17]、食品原料的干制[18-19]、活性成分的干制[20-22]等方面，取得了良好的效果。與其他方法相比，真空冷凍干燥技術處理菌株存活率較高，菌株活性保持較好，遺傳特性較為穩(wěn)定，復水再生性良好、便于長期儲存和不易變質(zhì)等[23-24]。近些年，前人將真空冷凍干燥技術用于保藏霉菌菌種如白地霉[25]、黑曲霉[15]、棒曲霉[14]等，但關于棘孢木霉真空冷凍干燥的研究鮮有報道。

本文主要是通過真空冷凍干燥技術將棘孢木霉菌液有效的轉(zhuǎn)化成相對穩(wěn)定、易于運輸?shù)募吣久咕?，此狀態(tài)下的菌種輕便、干燥，在運輸、應用及保藏方面相當便捷。另外，通過將凍干后的菌粉進行復蘇發(fā)酵培養(yǎng)，探究凍干處理對棘孢木霉發(fā)酵穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棘孢木霉菌Trichoderma asperelham（中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏號為CGMCC No：14636）作為本試驗的目的菌株，由湖南省果蔬清潔加工工程技術中心從湖南邵陽柑桔園中采樣獲得，再從以桔皮粉為主要成分的選擇性培養(yǎng)基[26]中分離得出。挑選品質(zhì)相同、大小相似的市售湘西椪柑為供試果實。

脫脂牛奶：莫萊高博恩共營有限公司；Evans blue：生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

SCIENTZ-18N真空冷凍干燥機：寧波新芝生物科技股份有限公司；銀湖SP-780加氧泵：中山市日勝電器制品有限公司；DW-FL450A1超低溫冷凍儲存箱：中科美菱低溫科技股份有限公司；BA310 Digital顯微鏡：麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；SW-CJ-1D凈化工作臺：蘇州智凈凈化設備有限公司；IS-RDD3恒溫振蕩培養(yǎng)箱：美國精騏儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 制備凍干菌粉的工藝流程

取-40℃40%甘油管保藏的棘孢木霉菌，溶解，在無菌條件下接入液體培養(yǎng)基[26]中，在30℃、160 r/min下培養(yǎng)48 h，活化培養(yǎng)兩次，然后用接種環(huán)將棘孢木霉菌接種于斜面培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，30℃培養(yǎng)6 d，備用。挑取斜面培養(yǎng)基中的棘孢木霉劃入空白平板中，30℃下培養(yǎng)6 d，然后，在無菌工作臺中，以5 mL無菌水將成熟的孢子洗出，裝入10 mL無菌螺口試管中，制取得孢子懸液，根據(jù)血球計數(shù)板法測定孢子的數(shù)量，用以確定孢子濃度，按要求調(diào)配脫脂牛奶的添加量，然后在-40℃冰箱中進行預凍，再進行真空冷凍干燥，收集干粉，制備得發(fā)酵劑。

1.2.2 菌液濃度測定

選用血球計數(shù)板法對菌懸液進行計數(shù)，即將菌懸浮液放在血球計數(shù)板與蓋片之間的計數(shù)室中，使用計數(shù)板25×16規(guī)格進行計數(shù)，每個樣品重復計數(shù)3次，取其平均值。公式如下：

1.2.3 菌種存活率測定

采用伊文思藍作為活菌計數(shù)的染色劑[27]，伊文思藍作為一種活性染料，可對死細胞進行著色，而未失活的細胞由于排異的作用而出現(xiàn)透明的情況，從而實現(xiàn)活菌計數(shù)。通過血球計數(shù)板法進行計數(shù)，計算得活菌數(shù)。菌種凍干存活率的計算：W/%=n2/n1×100式中：n1為未進行冷凍干燥前活菌數(shù)，個/mL；n2為凍干菌粉復水至凍干前體積活菌數(shù)，個/mL。

1.2.4 發(fā)酵液制備

凍干結束后，將菌粉以凍干前相同體積的無菌水在無菌條件下復溶，取出5 mL計數(shù)用，取1 mL 1×107個/mL加入到裝有500 mL桔皮粉液體培養(yǎng)基的1 000 mL錐形瓶中，在30℃、160 r/min條件下，培養(yǎng)時間 72 h，離心取上清液（4℃，10 min，3 800 r/min），備用。

1.2.5 發(fā)酵液降解試驗

采用8瓣/200mL（500mL塑料燒杯），功率為5W、氣壓為0.025MPa的加氧泵進行鼓泡，降解溫度為50℃，待其達到70%降解效果后，取出，記錄降解所需時間。

1.2.6 發(fā)酵液降解效果評價指標

參考李杰等[28]對柑橘橘皮及囊衣降解效果的評價標準并做相應修改，感官評價標準如下：

表1 感官評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of Ponkan segments

1.2.7 單因素試驗

1.2.7.1 保護劑添加量的確定

在菌液濃度為1×108個/mL，預凍時間為12 h的情況下，選定凍干保護劑添加量分別為14、16、18、20、22%5個水平進行真空冷凍干燥，每個水平3組平行，以存活率、橘瓣降解時間為指標，獲得最佳的保護劑添加量。

1.2.7.2 菌液濃度的確定

在保護劑添加量為20%，預凍時間為12 h的情況下，將菌液的濃度分別調(diào)配成 1×106、1×107、1×108、1×109個/mL 4個水平進行凍干處理，每個水平3組平行，以存活率、降解時間為指標確定最佳菌液濃度。

1.2.7.3 預凍時間的確定

在保護劑添加量為20%、菌液濃度為1×108個/mL的情況下，選定預凍時間為12、18、24、30 h 4個水平進行真空冷凍干燥處理，每個水平3組平行，以存活率、降解時間為指標確定最佳真空冷凍干燥預凍時間。

1.2.8 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，進行三因素三水平的正交試驗優(yōu)化，確定最佳真空冷凍干燥工藝條件，因素水平表見表2。

表2 正交試驗水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結果以均值±標準差（mean±SD）表示，每個處理重復3次，采用Eexcel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 保護劑添加量

保護劑添加量與存活率及橘瓣降解時間的關系見圖1。

圖1 保護劑添加量與存活率及橘瓣降解時間的關系Fig.1 The relationship between content of cryoprotectant and servival rate and the degradation time of Ponkan segments

由圖1可知，保護劑添加量從14%到20%之間，菌株的存活率上升速度最快，降解時間也逐漸變短，而20%之后菌株的存活率增長緩慢，降解時間逐漸趨于穩(wěn)定。綜上，選擇凍干保護劑添加量為20%進行后續(xù)的試驗。

2.1.2 菌液濃度

菌液濃度與存活率及橘瓣降解時間的關系見圖2。

圖2 菌液濃度與存活率及橘瓣降解時間的關系Fig.2 The relationship between the concentration of bacterial solution and servival rate and the degradation time of Ponkan segments

由圖2可知，菌液濃度從1×106個/mL到1×108個/mL之間，菌株的存活率呈急劇上升的趨勢，降解時間逐漸變短，在1×108個/mL時，存活率達到最大值，降解時間達到最小值，而1×108個/mL之后菌株的存活率下降，降解時間加長。綜上，選擇菌液濃度為1×108個/mL進行后續(xù)的試驗。

2.1.3 預凍時間

預凍時間與存活率及橘瓣降解時間的關系見圖3。

圖3 預凍時間與存活率及橘瓣降解時間的關系Fig.3 The relationship between pre-freezing time andand servival rate and the degradation time of Ponkan segments

由圖3可知，預凍時間在24 h時，存活率達到最大值，降解時間達到最小值，而少于或超過24 h菌株的存活率下降，降解時間延長?？赡艿脑蚴穷A凍時間太長導致菌株死亡或失去活性，而預凍時間短物料未能預凍完全，在抽真空的過程中發(fā)生飛灑而導致其損失。綜上，選擇最佳預凍時間為24 h。

2.2 正交試驗

正交試驗結果及數(shù)據(jù)分析見表3。

表3 正交試驗結果及數(shù)據(jù)分析Table 3 Experimental design and result of orthogonal experiments

根據(jù)極差Rs、Rd可判斷出各因素對真空冷凍干燥工藝的影響為：B＞A＞C（菌液濃度＞保護劑添加量＞預凍時間）。從表3中我們看出，棘孢木霉的最佳凍干工藝為A2B2C2，即菌液濃度為1×108個/mL，脫脂牛奶保護劑添加量為20%，預凍時間為24 h。

2.3 驗證試驗

在最佳條件下，即菌液濃度為1×108個/mL，脫脂牛奶保護劑添加量為20%，預凍時間為24 h，進行真空冷凍干燥處理，重復3次，菌株的存活率達到81.25%，橘瓣的降解時間為31 min，由此可見，經(jīng)過真空冷凍干燥處理后，棘孢木霉活性保持良好。

3 結論

通過單因素試驗和正交試驗，確定棘孢木霉菌株的最佳真空冷凍干燥工藝參數(shù)為：保護劑添加量為20%，預凍時間為 24 h，菌液濃度為 1×108個/mL，在最優(yōu)條件下，菌株的存活率達到81.25%，橘瓣降解所需時間為31 min為木霉菌的真空冷凍干燥提供參考依據(jù)，也為菌株保藏和運輸帶來了便捷。