周圓 尹悅 馮俊僑 楊敏 蔡嘉慧 吳昌睿 馬樂 張瑋

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是導致中老年人中心視力喪失的重要原因[1-2]。目前，全球AMD的患病率已達8.9%，且呈上升趨勢，已造成巨大的社會和經(jīng)濟負擔[3]。已有研究證實，AMD發(fā)生可能與視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞慢性氧化損傷密切相關(guān)[4]。作為三聯(lián)組氨酸蛋白超家族的重要成員，三聯(lián)組氨酸核苷結(jié)合蛋白1(histidine triad nucleotide binding protein 1，HINT1)起先被認為是一種調(diào)控內(nèi)源性凋亡實現(xiàn)腫瘤抑制的胞內(nèi)蛋白[5]。新近研究顯示，老年HINT1基因敲除鼠相比同品系青年鼠，表現(xiàn)為焦慮樣、抑郁樣行為增多，認知水平下降，提示其與衰老相關(guān)，可能參與多種退行性疾病的發(fā)生[6-7]。已有研究發(fā)現(xiàn)，在氧化損傷發(fā)生時RPE細胞形態(tài)呈明顯早衰征象，并最終出現(xiàn)凋亡和壞死，提示HINT1可能參與氧化損傷誘導的RPE細胞凋亡，進而參與AMD的發(fā)病過程[8]。本實驗以不同濃度過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)處理RPE細胞作為研究對象，通過觀察細胞活力和增殖情況判定RPE細胞氧化損傷的程度，從而確定合適的H2O2濃度；檢測BAX和BCL-2蛋白表達量的變化，判定機體內(nèi)凋亡水平；檢測RPE細胞中HINT1蛋白表達量變化，以明確HINT1在RPE細胞氧化損傷中的作用，為深入研究AMD的發(fā)病機制及尋找潛在藥物作用靶點提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器人ARPE-19細胞(美國模式菌種收集中心，ATCC)，H2O2(Sigma，美國)，改良型RPMI-1640培養(yǎng)液(HyClone，美國)，胎牛血清(HyClone，美國)，青鏈霉素混合液(含青霉素10×106U·L-1、鏈霉素10×103mg·L-1；Solarbio公司，美國)，2.5 g·L-1胰蛋白酶溶液(Solarbio公司，美國)，LIVE/DEAD Viability Cytotoxicity 試劑盒(Probes公司，美國)，BAX單克隆抗體(Cat.AF0120，Affinity Biosciences，美國)，BCL-2單克隆抗體(Cat.AF6319，Affinity Biosciences，美國)，HINT1單克隆抗體(Cat.ab124912，Abcam，美國)，β-actin單克隆抗體(Cat.C4，Santa Cruz Biotech，美國)等。

1.2方法

1.2.1RPE細胞培養(yǎng)人ARPE-19細胞復蘇后，加入RPMI-1640細胞完全培養(yǎng)液(含體積分數(shù)10%胎牛血清及10 g·L-1青鏈霉素混合液)，置于37 ℃、含體積分數(shù)5%CO2細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，第2天換液。根據(jù)細胞生長速度以12比例傳代繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)生長期，即細胞生長至80%融合時用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化，室溫下以800 r·min-1離心5 min，收集細胞并進行細胞計數(shù)；在細胞培養(yǎng)板上以7×106個·L-1的密度接種對數(shù)生長期RPE細胞，培養(yǎng)24 h后細胞貼壁生長至 80%～90%融合。

1.2.2氧化損傷模型的建立分別對RPE細胞予以不同濃度的H2O2處理。加入含H2O2的RPMI-1640細胞培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)H2O2的終濃度分別為0 μmol·L-1(對照組)、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、400 μmol·L-1和600 μmol·L-1(共計6組)，然后置于相同環(huán)境中培養(yǎng)6 h，棄上清液，PBS沖洗3次終止。

1.2.3LIVE/DEAD雙熒光染色法檢測細胞活力按LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity試劑盒說明書操作。加入染料工作液，熒光顯微鏡下觀察細胞熒光，隨機選取10個視野(×200)，計數(shù)其中呈綠色熒光的活細胞和呈紅色熒光的死細胞數(shù)目，計算6組細胞的死亡率。

1.2.4MTT法檢測細胞活力RPE細胞以每孔 7×103個接種于96 孔板，貼壁后給予不同濃度梯度H2O2干預6 h，之后每孔避光加入20 μL的5 g·L-1MTT溶液，原培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后小心棄去上清液，每孔加入200 μL DMSO溶液，用多功能酶標儀于492 nm波長處測出每孔吸光度(A)值。每組設(shè)定5個復孔，實驗重復3次取平均值，計算各組細胞生存率。

1.2.5Western blot檢測RPE細胞內(nèi)BAX、BCL-2、HINT1的表達使用RIPA裂解液提取總蛋白。蛋白上樣量為每孔40 μg，以150 g·L-1SDS-PAGE分離不同分子質(zhì)量的蛋白，切取含目的蛋白的膠濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用50 g·L-1脫脂奶粉于搖床上室溫封閉膜2 h；分別加入11000稀釋的兔抗人BAX抗體、兔抗人BCL-2抗體、12000稀釋的兔抗人HINT1抗體、4 ℃孵育過夜；用TBST洗滌5次，每次8 min，后加入15000山羊抗兔二抗于室溫孵育 1 h；ECL顯色，采用Bio-Rad凝膠成像儀采集圖像。得到條帶用Image-lab進行灰度值分析。

1.3統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示。使用單因素方差分析比較組間差異；如差異顯著，采用LSD法進行組間的兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1H2O2對RPE細胞活力的影響LIVE/DEAD熒光雙染色結(jié)果顯示，對照組、50 μmol·L-1H2O2組、100 μmol·L-1H2O2組、200 μmol·L-1H2O2組、400 μmol·L-1H2O2組及600 μmol·L-1H2O2組RPE細胞死亡率分別(0.35±0.11)%、(2.03±0.87)%、(3.76±1.41)%、(12.17±1.26)%、(17.69±2.24)%、(25.22±0.59)%(圖1)。與對照組相比，不同濃度H2O2處理組RPE細胞死亡數(shù)顯著增多；RPE細胞死亡率隨H2O2濃度的上升而增長，當H2O2濃度 ≥ 200 μmol·L-1時，細胞死亡率出現(xiàn)顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

圖1不同濃度的H2O2對RPE細胞活力的影響(×200，標尺：50 μm)。A：對照組；B：50 μmol·L-1 H2O2 組；C：100 μmol·L-1 H2O2組；D：200 μmol·L-1 H2O2 組；E：400 μmol·L-1 H2O2組；F：600 μmol·L-1 H2O2組

2.2H2O2對RPE 細胞增殖的影響不同濃度H2O2處理6 h后，MTT 細胞增殖實驗結(jié)果顯示對照組、50 μmol·L-1H2O2組、100 μmol·L-1H2O2組、200 μmol·L-1H2O2組、400 μmol·L-1H2O2組及600 μmol·L-1H2O2組細胞生存率分別為(40.72±2.71)%、(37.75±0.62)%、(35.30±0.68)%、(34.10±0.74)%、(33.61±0.71)%、(31.05±1.41)%。與對照組相比，不同濃度H2O2處理組RPE細胞隨著H2O2濃度的增加，細胞生存率顯著下降(P<0.05)，并呈顯著的劑量-效應關(guān)系。2.3H2O2對RPE細胞中凋亡相關(guān)蛋白BAX、BCL-2表達的影響H2O2處理組相比于對照組，其RPE細胞中的BAX表達上調(diào)(P<0.01)，而各組細胞中BCL-2表達下調(diào)(P<0.01)。BAX/BCL-2比值相比對照組均升高，分別升高1.85倍(50 μmol·L-1H2O2組)、2.35倍(100 μmol·L-1H2O2組)、2.86倍(200 μmol·L-1H2O2組)、3.97倍(400 μmol·L-1H2O2組)、8.50倍(600 μmol·L-1H2O2組)，表示細胞內(nèi)凋亡水平升高(圖2)。

2.4H2O2對RPE 細胞中HINT1表達的影響與對照組相比，不同濃度H2O2處理組HINT1表達水平隨H2O2濃度增加而下降(P<0.05)，分別下降0.78倍(50 μmol·L-1H2O2組)、0.59倍(100 μmol·L-1H2O2組)、0.45倍(200 μmol·L-1H2O2組)、0.42倍(400 μmol·L-1H2O2組)、0.38倍(600 μmol·L-1H2O2組)，且呈明顯的劑量依賴性(圖3)。

圖2不同濃度的H2O2對RPE細胞內(nèi)BAX和BCL-2蛋白表達的影響(與對照組相比，**P<0.01)。A：對照組和不同濃度H2O2組RPE細胞內(nèi)BAX蛋白的表達；B：對照組和不同濃度H2O2組RPE細胞內(nèi)BCL-2蛋白的表達；C：對照組和不同濃度H2O2組BAX/BCL-2的比值

圖3不同濃度的H2O2對RPE細胞內(nèi)HINT1蛋白表達的影響 (與對照組相比，**P<0.01)

3討論

氧化應激是導致AMD發(fā)生的重要因素。臨床研究結(jié)果表明，補充抗氧化劑可延緩AMD的發(fā)生發(fā)展[9]。作為人體氧消耗最大的組織之一，視網(wǎng)膜特殊生理環(huán)境往往會產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)[10-11]。當ROS產(chǎn)生量超出機體抗氧化能力時，則會導致視網(wǎng)膜蛋白及核酸的損傷[12]。H2O2是一種由細胞代謝產(chǎn)生的非活性氧自由基，可被轉(zhuǎn)化為氧化能力極強的活性羥自由基，加劇細胞的氧化損傷，因此常被用于誘導體外氧化應激[12]。以往研究結(jié)果表明，H2O2在短時間內(nèi)可誘導RPE細胞出現(xiàn)周期暫停、增殖停滯[10，13-14]。與以往研究相似，本研究結(jié)果顯示，50～600 μmol·L-1H2O2處理RPE細胞可導致不同程度的細胞活力下降及增殖能力減弱。有研究表明，H2O2對RPE細胞的影響與作用時間相關(guān)，Marazita等[8]用H2O2處理RPE細胞72 h，細胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶和細胞周期抑制基因p16、p21表達明顯增多，且產(chǎn)生DNA損傷產(chǎn)物，出現(xiàn)細胞早衰表型，提示RPE細胞衰老、功能失調(diào)及丟失可能是AMD發(fā)生的早期事件[15-16]。

目前對于H2O2致RPE細胞死亡的具體機制尚不清楚，可能與凋亡或壞死有關(guān)[12]。Barak等[17]對暴露于不同濃度H2O2的RPE細胞凋亡和壞死情況進行檢測發(fā)現(xiàn)，低濃度 H2O2主要導致RPE細胞凋亡，而高濃度H2O2主要導致細胞壞死。Kim等[18]提出H2O2誘導的RPE細胞死亡機制可能是凋亡和壞死兩者兼有，且與H2O2劑量有關(guān)。作為凋亡發(fā)生的重要信號，ROS可誘導氧化應激，從而激活細胞凋亡內(nèi)源性信號通路。這一內(nèi)源性的信號通路通常被線粒體中的抗凋亡蛋白BCL-2以及促凋亡蛋白BAX所調(diào)節(jié)[18]。本研究對凋亡蛋白家族中重要蛋白BAX和BCL-2進行分析后發(fā)現(xiàn)，BAX表達上調(diào)而BCL-2表達下調(diào)，其BAX/BCL-2比值顯著上升，提示H2O2處理后RPE細胞內(nèi)凋亡途徑啟動，與以往研究結(jié)果基本一致[19-20]。

作為一種年齡相關(guān)的退行性眼病，AMD具有眾多與阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease，AD)等退行性疾病相似的病理特征，如β淀粉樣蛋白沉積，且與AD共享相似的遺傳背景[21]。已有資料顯示，AMD患者Wnt-β-catenin通路中關(guān)鍵分子表達上調(diào)。作為Wnt通路的間接抑制劑，HINT1表達下調(diào)可導致Wnt通路激活，誘導AMD的發(fā)生[22-23]。以往研究對出現(xiàn)AD樣行為倭狐猴大腦測序，發(fā)現(xiàn)與青年倭狐猴相比，隨著機體衰老，老年倭狐猴HINT1表達下降[24]。HINT1可能是反映機體發(fā)生退行性改變的關(guān)鍵分子，也提示HINT1可能影響RPE細胞損傷過程，參與AMD的發(fā)生。此外，以往研究表明，HINT1與內(nèi)源性凋亡途徑關(guān)系密切，可通過調(diào)控內(nèi)源性凋亡途徑參與AMD的發(fā)生[25]。本研究結(jié)果顯示，H2O2氧化損傷RPE細胞后 HINT1的表達呈劑量依賴性下降，提示HINT1對RPE細胞可能具有潛在的保護作用，從而延緩AMD的發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，H2O2氧化損傷將通過抑制HINT1表達引起凋亡發(fā)生，誘導RPE細胞的衰老及生長停滯。本研究為驗證HINT1作為AMD潛在治療靶點提供了一定的參考依據(jù)。