蔡暉 石華宗 楊豫湘

視網(wǎng)膜新生血管形成是導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜病變、眼底血管栓塞、青光眼等疾病視力喪失的重要原因之一[1-3]。視網(wǎng)膜新生血管的形成是極其復(fù)雜的過程，伴隨出血、滲出及增殖等病理性改變[4]。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及炎癥反應(yīng)是新生血管形成過程中最為重要的環(huán)節(jié)[5]，且人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal capillary endothelial cell，HREC)是研究視網(wǎng)膜新生血管形成過程必不可缺的細(xì)胞系之一。已有研究報道，低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor 1 alpha，HIF-1α)是細(xì)胞感受氧含量高低并作出調(diào)控反應(yīng)的關(guān)鍵性分子，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH、促進(jìn)血管生成、誘導(dǎo)自噬、調(diào)控凋亡、自身免疫以及促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞自我更新與分化的功能[6-8]。目前關(guān)于HIF-1α在HREC中的功能尚不清楚，本研究擬通過在體外培養(yǎng)HREC過表達(dá)HIF-1α，同時采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)和Western blot分別檢測其對HREC增殖、炎癥反應(yīng)及血管生成的影響，為視網(wǎng)膜血管性疾病的治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料HREC(中山大學(xué)中山眼科中心提供)，pEGFP-HIF-1α重組載體及pEGFP-C1空白載體(賽業(yè)生物科技有限公司)，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β及IL-6 ELISA試劑盒(Thermo Fisher Scientific，美國)，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及GAPDH抗體(Abcam)，DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(Thermo Fisher Scientific，美國)，胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加物(上海艾研生物科技有限公司)，內(nèi)皮細(xì)胞生長因子 (上海偉進(jìn)生物科技有限公司)，青霉素、鏈霉素、MTT及DMSO(Sigma，美國)，Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑(Thermo Fisher Scientific，美國)，RNA提取試劑盒(Trizol，美國)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒(Takara，日本)。電泳儀(BIO-RAD，美國)，E-Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)(Invitrogen，美國)，ABI 7100熒光定量PCR儀(ABI，美國)，細(xì)胞培養(yǎng)箱和超凈工作臺(BIO-RAD，美國)，酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific，美國)。

1.2體外培養(yǎng)HRECHREC采用DMEM培養(yǎng)基及體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并添加胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加物、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、青霉素(100×103U·L-1)及鏈霉素(0.1 g·L-1)。常規(guī)傳代、接種及鋪板。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染待HREC傳代至第3-4代時，取對數(shù)期生長的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體操作如下：取HREC進(jìn)行6孔板鋪板，每孔細(xì)胞數(shù)約為500×103個，常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，依照Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑操作流程分別轉(zhuǎn)染pEGFP-HIF-1α重組載體和pEGFP-C1空白載體，轉(zhuǎn)染6 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，待轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞。

1.4MTT實(shí)驗(yàn)取HREC進(jìn)行96孔板鋪板，每孔細(xì)胞數(shù)約為6000個，細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染同上，連續(xù)4 d每孔每天加入14 μL MTT(5 g·L-1)，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h后去掉上清，隨后每孔加入150 μL DMSO，在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育15 min，最后采用酶標(biāo)儀測定各組480 nm波長時的吸光度(A)值。

1.5ELISA實(shí)驗(yàn)取HREC進(jìn)行6孔板鋪板，細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染同上，待轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞。參照Thermo Fisher Scientific提供的TNF-α、IL-1β及IL-6 ELISA試劑盒檢測各組HREC中TNF-α、IL-1β及IL-6蛋白的含量。

1.6Western blot檢測提取HREC總蛋白，常規(guī)定量和變性。制備120 g·L-1SDS聚丙烯酰胺凝膠，常規(guī)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉，加入抗VEGF及GAPDH一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，37 ℃孵育二抗 1 h，再次TBST洗滌3次，暗室添加ECL發(fā)光液孵育20 s及曝光拍照。

1.7熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)提取HREC總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以合成的cDNA作為模板在ABI 7100熒光定量PCR儀上進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增條件為：98 ℃ 10 min，隨后95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共46個循環(huán)。HIF-1α 上游引物：5’-GTTACAGTATTCCAGCAGA-3’，下游引物：5’-GTATGTGGGTAGGAGATG -3’；GAPDH上游引物：5’-TCAAGAAGGTGGTGAAGC-3’，下游引物：5’-AAGGTGGAGGAGTGGGT-3’。反應(yīng)體系如下：無RNase去離子水 10 μL、cDNA 1 μL、上游引物和下游引物各0.5 μL及SYBR premix 8 μL。

2結(jié)果

2.1過表達(dá)HIF-1α對體外培養(yǎng)HREC中HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)的影響轉(zhuǎn)染人工合成的pEGFP-HIF-1α重組載體或pEGFP-C1空白載體至HREC，并通過熒光定量PCR檢測細(xì)胞中HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pEGFP-C1后HREC中HIF-1α mRNA的表達(dá)量為0.50±0.08，而轉(zhuǎn)染pEGFP-HIF-1α后HREC中HIF-1α mRNA表達(dá)量為4.63±0.92，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Western blot檢測亦發(fā)現(xiàn)體外轉(zhuǎn)染pEGFP-HIF-1α可顯著增加HREC中HIF-1α蛋白表達(dá)(P<0.05)。見圖1。

2.2過表達(dá)HIF-1α對體外培養(yǎng)HREC增殖的影響過表達(dá)HIF-1α可顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)HREC增殖，HREC轉(zhuǎn)染pEGFP-HIF-1α后24 h、48 h及72 hA值分別為0.34±0.04、0.57±0.04、0.83±0.05，而HREC轉(zhuǎn)染pEGFP-C1后24 h、48 h及72 hA值分別為0.26±0.03、0.44±0.04、0.61±0.04，兩者相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。

圖1過表達(dá)HIF-1α對體外培養(yǎng)HREC中HIF-1α蛋白表達(dá)的影響

2.3過表達(dá)HIF-1α對體外培養(yǎng)HREC炎癥反應(yīng)的影響轉(zhuǎn)染pEGFP-HIF-1α后HREC中TNF-α、IL-1β及IL-6蛋白的表達(dá)較轉(zhuǎn)染pEGFP-C1后均顯著增加，兩者相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。結(jié)果見表1和圖2。

表1TNF-α、IL-1β及IL-6蛋白的表達(dá)變化

2.4過表達(dá)HIF-1α對體外培養(yǎng)HREC血管生成的影響Western blot檢測顯示(圖3)，過表達(dá)HIF-1α可顯著增加體外培養(yǎng)HREC中VEGF蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)染pEGFP-HIF-1α后HREC VEGF蛋白的表達(dá)為6.72±0.96，而轉(zhuǎn)染pEGFP-C1后HREC VEGF蛋白的表達(dá)為2.31±0.47，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖3過表達(dá)HIF-1α對體外培養(yǎng)HREC中VEGF蛋白表達(dá)的影響

3討論

視網(wǎng)膜新生血管性疾病是當(dāng)今世界范圍最主要的致盲性眼病之一，隨著我國老齡化程度的提高，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢，嚴(yán)重危害人們的身體健康。視網(wǎng)膜新生血管的形成是一個復(fù)雜的病理生理過程，缺氧、缺血及高糖狀態(tài)是誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管形成的重要因素[9-10]。HIF-1α是主要的氧調(diào)節(jié)亞基，在常氧狀態(tài)下易經(jīng)泛素酶體途徑降解，表達(dá)水平較低；而在低氧狀態(tài)下可與一些基因的氧反應(yīng)元件(hypoxia response element，HRE)結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)多種低氧反應(yīng)因子的表達(dá)，從而使細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境[11-12]。

已有研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在大多數(shù)癌組織呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，如肝癌、胰腺癌、乳腺癌和腎癌等，HIF-1α可作為這些腫瘤治療新的分子靶點(diǎn)[13-15]。HIF-1α在其他疾病，如骨折、牙周炎、冠心病和腦缺血性疾病中等亦呈高表達(dá)，提示其在這些疾病中亦發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[16-17]。最新研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)HIF-1α表達(dá)可改善心肌和小腸缺血-再灌注損傷[18-19]。HREC與牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞相比，具有人體代表性，是研究視網(wǎng)膜新生血管形成過程必不可缺的細(xì)胞系之一。目前關(guān)于HIF-1α在HREC中的功能尚不清楚，本研究旨在探討過表達(dá)HIF-1α對體外培養(yǎng)HREC增殖、炎癥反應(yīng)及血管生成的影響。

通過MTT實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HIF-1α可顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)HREC增殖。該結(jié)果與過表達(dá)HIF-1α促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長的結(jié)果一致。細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在視網(wǎng)膜新生血管的形成中起著重要作用，TNF-α、IL-1β及IL-6是參與炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞因子。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)HIF-1α可顯著增加HREC中TNF-α、IL-1β及IL-6的表達(dá)水平，提示過表達(dá)HIF-1α可促進(jìn)體外培養(yǎng)HREC炎癥反應(yīng)。VEGF是必不可少的血管生成因子，可增加內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，誘導(dǎo)血管擴(kuò)張，使血漿蛋白形成纖維蛋白網(wǎng)。VEGF亦能誘導(dǎo)一些基因的表達(dá)，產(chǎn)生與細(xì)胞遷移、組織重塑有關(guān)的蛋白酶，參與新生血管的形成。本實(shí)驗(yàn)通過Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)HIF-1α可顯著增加體外培養(yǎng)HREC中VEGF蛋白表達(dá)，提示過表達(dá)HIF-1α可增加體外培養(yǎng)HREC血管生成。

綜上所述，本研究通過檢測過表達(dá)HIF-1α對體外培養(yǎng)HREC增殖、炎癥反應(yīng)及血管生成的影響，首次發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HIF-1α可顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)HREC增殖、炎癥反應(yīng)及血管生成，該研究將為視網(wǎng)膜血管性疾病的治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。