吉智 劉旭 王霞 何媛 閆菊娥

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性變造成的一種不可逆性視力下降或喪失的疾病，在西方國家已成為首位致盲性眼病，在亞洲其發(fā)病率亦呈逐漸增多的趨勢[1]。目前關(guān)于AMD發(fā)病機(jī)制并不十分清楚，因此缺乏有效治療方法[2]。近年來，有關(guān)脈絡(luò)膜血流量異常能促進(jìn)AMD發(fā)展的假說被提出[3-5]。而一氧化氮(nitric oxide，NO)是一種具有多種生理功能的強(qiáng)力血管擴(kuò)張劑，是眼球血流的重要調(diào)節(jié)因子。有研究表明，AMD患者的NO血漿水平的變化可能與脈絡(luò)膜灌注的調(diào)節(jié)有關(guān)[6]。此外，在AMD患者的眼中發(fā)現(xiàn)NO合酶亞型的水平顯著降低[7]。所有這些發(fā)現(xiàn)都提示NO可能與AMD視網(wǎng)膜神經(jīng)變性和脈絡(luò)膜血流動(dòng)力學(xué)改變有關(guān)。

在許多神經(jīng)退行性疾病中，色素上皮衍生因子(pigment epithelium-deriverd factor，PEDF)被廣泛地證明是一種神經(jīng)保護(hù)因子。PEDF是具有強(qiáng)神經(jīng)營養(yǎng)作用糖蛋白，我們之前的研究證實(shí)[8]PEDF通過穩(wěn)定線粒體網(wǎng)絡(luò)和功能，促進(jìn)衰老RPE細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的恢復(fù)力?；诖耍瑸樘接懖煌挲g段人RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中NO釋放水平以及PEDF對(duì)不同年齡段人RPE細(xì)胞中NO釋放的影響，本研究建立了不同年齡段人RPE氧化損傷模型，并檢測了不同年齡段及PEDF干預(yù)下人RPE細(xì)胞中NO的釋放水平、氧化損傷下不同年齡段人RPE細(xì)胞中NO的釋放水平。

1材料與方法

1.1材料原代人RPE細(xì)胞(來源于9～20歲，50～55歲，60～70歲，>70歲人群)由美國賓夕法尼亞大學(xué)和威斯康星大學(xué)Joyce Tombran-Tink博士贈(zèng)予。DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清購買于美國Gibco公司，NO檢測試劑盒購自美國Sigma公司，胰蛋白酶購于美國Gibco公司，H2O2、青霉素/鏈霉素和磷酸鹽緩沖鹽水(fetal bovine serum，PBS)購于中國西安依科生物技術(shù)有限公司。胰蛋白酶消化液已過濾滅菌，可直接用于細(xì)胞培養(yǎng)消化。將體積分?jǐn)?shù)為30%H2O2用DMEM培養(yǎng)基稀釋至300 μmol·L-1。PEDF購自美國PEPROTECH公司。將PEDF溶解在1×PBS補(bǔ)充物中，并在使用中用培養(yǎng)基稀釋到250 μg·L-1。

1.2RPE細(xì)胞培養(yǎng)及處理使用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱(Thermo，美國)培養(yǎng)RPE細(xì)胞，分別接種于12 孔培養(yǎng)板中。每周換液兩次，待細(xì)胞達(dá)到80%以上融合時(shí)，用胰蛋白酶消化傳代RPE細(xì)胞，通過光鏡(Nikon，日本)、掃描電鏡(飛利浦，德國)及免疫組織化學(xué)進(jìn)行鑒定[9-10]。將培養(yǎng)的原代細(xì)胞分為四組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別為不加任何物質(zhì)干預(yù)的陰性對(duì)照組，單獨(dú)加300 μmol·L-1 H2O2氧化損傷組處理2 h，為H2O2氧化損傷組，單獨(dú)加250 μg·L-1PEDF處理48 h為PEDF處理保護(hù)組以及同時(shí)加入250 μg·L-1PEDF+300 μmol·L-1 H2O2的損傷保護(hù)組，處理12 h，隨后用NO檢測試劑盒對(duì)各組細(xì)胞NO水平進(jìn)行檢測。

1.3不同年齡段RPE細(xì)胞內(nèi)NO水平測定取出NO試劑盒中Griess試劑Ⅰ和Ⅱ，恢復(fù)至室溫。使用培養(yǎng)基稀釋檢測試劑(1～100 μmol)。按每孔50 μL，在96孔板中加入檢測試劑及細(xì)胞。按每孔50 μL，在各孔中加入室溫Griess試劑Ⅰ和Ⅱ。應(yīng)用酶標(biāo)儀(Thermo，美國)測定波長為540 nm處的吸光度(A)值。確定樣品中NO的濃度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有結(jié)果采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 18.0進(jìn)行分析。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異的顯著性分析采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同年齡段人RPE細(xì)胞的體外培養(yǎng)結(jié)果細(xì)胞接種后，經(jīng)過2 d的體外靜止適應(yīng)期后，RPE細(xì)胞開始不斷分裂增殖，倒置相差顯微鏡觀察可見細(xì)胞貼壁，這些貼壁細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，大小不均，細(xì)胞透亮，可見清晰透明的圓形細(xì)胞核以及雙核細(xì)胞。胞漿內(nèi)含豐富黑色素顆粒，迅速分裂繁殖，5～7 d細(xì)胞基本單層融合(圖1)。陰性對(duì)照組中不同年齡段人RPE細(xì)胞的形態(tài)稍有差別，年齡越小，細(xì)胞狀態(tài)越飽滿。PEDF處理保護(hù)組中細(xì)胞形態(tài)與陰性對(duì)照組無明顯差異。H2O2氧化損傷組中各年齡段細(xì)胞均受到損傷，相鄰細(xì)胞發(fā)生粘連，細(xì)胞皺縮加重，死亡及懸浮細(xì)胞增多。而加入PEDF處理后，損傷保護(hù)組中細(xì)胞形態(tài)較H2O2氧化損傷組中的細(xì)胞胞質(zhì)更加飽滿，死亡細(xì)胞數(shù)量顯著減少。

2.2細(xì)胞內(nèi)NO水平測定結(jié)果應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測未做任何處理的細(xì)胞內(nèi)NO釋放量，結(jié)果顯示，隨著年齡的增長，陰性對(duì)照組中50～55歲，60～70歲，>70 歲RPE細(xì)胞內(nèi)NO的釋放水平分別是9～20歲年齡段的1.37倍、1.25倍、1.62倍，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(9～20歲與>70歲：P=0.231)。H2O2氧化損傷組9～20歲，50～55歲，60～70歲，>70歲RPE細(xì)胞內(nèi)NO的釋放水平分別是陰性對(duì)照組的1.35倍、1.15倍、0.98倍及1.05倍，NO的釋放量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。同時(shí)，對(duì)NO在H2O2刺激后的差值與年齡進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果顯示無顯著相關(guān)性(r=1.730)。不同年齡段RPE細(xì)胞經(jīng)過250 μg·L-1PEDF處理后，細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量雖有好轉(zhuǎn)，但NO的釋放水平結(jié)果顯示，PEDF處理保護(hù)組9～20歲、50～55歲、60～70歲、>70歲RPE細(xì)胞內(nèi)NO的釋放水平分別是陰性對(duì)照組的1.17倍、1.10倍、1.04倍及0.96倍，NO的釋放量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。

圖1不同年齡段及H2O2、PEDF處理后人RPE細(xì)胞的形態(tài)(倒置相差顯微鏡下觀察)

3討論

RPE被廣泛認(rèn)為是探討AMD發(fā)病機(jī)制的支點(diǎn)，并廣泛應(yīng)用于眼科的體外研究。此外，用于誘導(dǎo)氧化損傷的H2O2濃度在公認(rèn)的氧化損傷模型的范圍內(nèi)。本研究結(jié)果顯示未做任何處理的細(xì)胞內(nèi)NO釋放水平?jīng)]有明顯變化，H2O2對(duì)各組細(xì)胞中NO的產(chǎn)生無明顯影響。可能原因如下：一方面，NO是一種重要的信號(hào)分子，它作用于多種組織，調(diào)節(jié)多種生理和細(xì)胞過程，包括神經(jīng)傳導(dǎo)、免疫防御、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)[11]。由于內(nèi)皮細(xì)胞釋放的NO參與眼球血流調(diào)控，其對(duì)血管張力系統(tǒng)和眼血流的調(diào)節(jié)都有著重要作用。內(nèi)皮功能障礙時(shí)降低了NO的生物利用度，增加活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，損害了眼球血流動(dòng)力學(xué)[11]。有證據(jù)顯示，AMD患者的脈絡(luò)膜血流是受損的[12]。在衰老過程中，ROS和抗氧化物之間的平衡會(huì)受到破壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞與組織的氧化損傷。而NO在組織中的合成和降解也是一種動(dòng)態(tài)平衡，ROS可迅速滅活NO。在正常的生理?xiàng)l件下，內(nèi)生防御系統(tǒng)對(duì)抗氧化，維持NO合成與ROS降解的平衡。然而，這種微妙的平衡可能會(huì)被改變，尤其是在衰老和AMD形成的過程中，這種改變導(dǎo)致了NO水平的降低，從而削弱了血管的松弛功能[6]。另一方面，誘導(dǎo)型NO合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)在炎癥介質(zhì)的影響下釋放NO，引起神經(jīng)變性和細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致嚴(yán)重的眼部疾病[13]。Cillà等[14]發(fā)現(xiàn)，NO由iNOS催化L-精氨酸脫胍基而產(chǎn)生，對(duì)RPE細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在正常生理?xiàng)l件下，NO 主要通過神經(jīng)元型(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)與內(nèi)皮型NO合成酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)催化形成，iNOS一般未發(fā)揮作用。在病理狀態(tài)下，受到缺氧、缺血或創(chuàng)傷刺激，iNOS 表達(dá)增多，經(jīng)誘導(dǎo)合成釋放大量NO，加重RPE損傷，促進(jìn)其凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長，RPE細(xì)胞內(nèi)NO水平?jīng)]有明顯變化，H2O2對(duì)RPE細(xì)胞中NO產(chǎn)生的誘導(dǎo)作用差異也無顯著性意義，這提示我們在不同年齡段人RPE細(xì)胞中NO的兩種完全相反的作用可能處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡中，故釋放水平無明顯變化。

PEDF 則為從RPE細(xì)胞內(nèi)提取的神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)，有研究證明PEDF通過保護(hù)RPE細(xì)胞免受局部缺血及細(xì)胞毒性引起的死亡[15]，它還對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)神經(jīng)元具有保護(hù)作用，也有研究證明其可保護(hù)氧化損傷引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)元死亡[16]。而我們前期研究發(fā)現(xiàn)，PEDF保護(hù)了氧化損傷下的RPE細(xì)胞[8]，主要通過以下幾個(gè)途徑：(1)PEDF可以增加氧化應(yīng)激損傷下的RPE細(xì)胞活性；(2)PEDF可以抑制ROS的產(chǎn)生來減少RPE細(xì)胞死亡；(3)PEDF可維持線粒體正常的結(jié)構(gòu)和功能，通過線粒體保護(hù)途徑來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，減少細(xì)胞凋亡；(4)調(diào)節(jié)參與細(xì)胞凋亡基因Bax、caspase-3和Bcl-2的表達(dá)。這些都肯定了PEDF在RPE細(xì)胞氧化損傷中的保護(hù)作用。但本研究中PEDF對(duì)RPE細(xì)胞中NO的釋放無明顯影響，這提示我們PEDF對(duì)RPE細(xì)胞的保護(hù)作用不通過NO途徑。

綜上所述，NO一方面參與了視網(wǎng)膜血供系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，舒張了血管；另一方面又參與了RPE細(xì)胞氧化損傷病理過程，是誘導(dǎo)RPE細(xì)胞凋亡的重要原因。由于這兩種完全不同的作用，人們在制定治療策略時(shí)可能會(huì)遇到困難，是采取對(duì)NO的補(bǔ)充或是對(duì)NO合酶抑制的治療方案？而采用PEDF 干預(yù)的確可以保護(hù)RPE細(xì)胞，但對(duì)NO的釋放無明顯影響。