王振玲,李淼煊,孫 欣,程廣宇,劉春法,岳瑞超,王 杰,廖 軼,周向梅

(1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院,北京 房山 102445;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀 100193)

結(jié)核病(TB)是一種起源很早的可共同感染人與動(dòng)物的慢性傳染性疾病。在19世紀(jì)終期才被Robert Koch證實(shí)為細(xì)菌性疾病,至此人們才開始進(jìn)一步研究和了解該病,其多為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)引起。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)提供的信息,僅在2016年就有170萬人死于結(jié)核病(四分之一感染有艾滋病病毒),其中只有近5%死亡發(fā)生在高等收入國家。我國結(jié)核病新發(fā)病例數(shù)位于印度和印度尼西亞之后,是危害我國公共健康的重大傳染病之一。

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群根據(jù)基因組多樣性和宿主傾向性,分為結(jié)核分支桿菌(M.tuberculosis)、牛分枝桿菌(M.bovis)、非洲分支桿菌(M.africanum)、Caprae分支桿菌(M.caprae)等。前兩種分支桿菌是對(duì)全球影響最大的病原體,宿主范圍極廣,可在人、寵物、家畜以及野生動(dòng)物之間相互傳播。2012年Kira E.F.Ramdas[1]等人發(fā)現(xiàn)貓的肺中出現(xiàn)結(jié)核病變,而其主人患有結(jié)核病。該病的傳播途徑多種多樣,可通過分泌的乳汁、排出的尿液、糞便、膿液和痰、以及呼出的氣體,污染食物、墊料等經(jīng)呼吸道、消化道進(jìn)入機(jī)體,即直接接觸傳播或者接觸患病動(dòng)物的呼氣和排泄物傳播[2]。

近10年由于我國牛奶和牛肉市場(chǎng)需求增大,奶牛養(yǎng)殖行業(yè)飛速發(fā)展呈規(guī)模化、集約化,牛結(jié)核病發(fā)病率出現(xiàn)逐步攀升的勢(shì)頭,陽性率甚至高達(dá)9%[3]。據(jù)估計(jì),上個(gè)世紀(jì)前葉,牛結(jié)核病造成的家畜損失高于其他傳染病的總和,對(duì)于整個(gè)養(yǎng)殖行業(yè)的經(jīng)濟(jì)有著嚴(yán)重的影響。同時(shí),人們可以通過飲用未殺菌的牛奶或未加工的生牛肉感染結(jié)核病[3],其威脅著我國十幾億人口的健康,因此,研究和防治牛結(jié)核病迫在眉睫。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株 本試驗(yàn)所用牛分枝桿菌致弱株由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)國家動(dòng)物海綿狀腦病實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 于某牛場(chǎng)購買3～6月齡的犢牛,用PPD和IFN-γ釋放試驗(yàn)檢測(cè)為結(jié)核病雙陰性,隔離飼養(yǎng)于圈舍。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌懸液的制備 在7H9液體培養(yǎng)基中接種細(xì)菌,培養(yǎng)于恒溫37℃的搖床中。培養(yǎng)6～8周后,倍比稀釋菌液并接種于7H10固體培養(yǎng)基中,然后開始菌落形成單位(CFU)計(jì)數(shù),將細(xì)菌數(shù)量為1×103CFU的菌液置于-80℃冰箱中保存待用。

1.3.2 動(dòng)物的分組及接種方法 將6頭犢牛分為對(duì)照組和試驗(yàn)組,每組各3頭,做標(biāo)記。選用滴鼻吸入接種的方法,用5 mL注射器吸取菌液2 mL,試驗(yàn)組犢牛每頭每側(cè)鼻孔注入1 mL,感染劑量為2×103CFU。

1.3.3 病理組織學(xué)觀察 將兩組犢牛有病變或疑似有病變的部位(心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)、胃、腸等器官)切取下來,固定于10%福爾馬林。樣本固定后經(jīng)常規(guī)組織處理,石蠟包埋,2～4 μm切片,采用H.E.染色,放于光學(xué)顯微鏡下觀察,采集圖像并記錄觀察結(jié)果。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 病理組織學(xué)觀察

2.1.1 肝臟 低倍鏡可見肝小葉中肝細(xì)胞索排列紊亂,肝細(xì)胞腫脹,中央?yún)^(qū)域肝竇消失(見中插彩版圖1A)?？梢娙庋磕[形成初期,大量炎性細(xì)胞浸潤,有的聚集形成嗜堿性深染的炎性灶(見中插彩版圖1B)。還見到粉色均質(zhì)物質(zhì)中心為部分藍(lán)染鈣化的干酪樣壞死,外周有炎性細(xì)胞浸潤,其中含有馬蹄形或圓形多核巨細(xì)胞(見中插彩版圖1C)。

高倍鏡可見肝細(xì)胞腫脹呈多角形,胞核偏向一側(cè),細(xì)胞質(zhì)減少呈弱嗜酸性,胞間界限不明顯。肝血竇中充滿紅細(xì)胞,部分可見狄氏隙(見中插彩版圖2A)。浸潤的炎性細(xì)胞有的胞核圓且嗜堿性深染,胞質(zhì)極少為淋巴樣細(xì)胞,有的細(xì)胞核呈分葉或桿狀,胞質(zhì)嗜酸性染色,為嗜中性粒細(xì)胞。肉芽腫早期的炎性灶區(qū)域的細(xì)胞呈兩端尖中間圓的梭型,胞質(zhì)減少呈淺粉色,胞核大而空亮,出現(xiàn)上皮樣細(xì)胞增生和纖維化(見中插彩版圖2B)。鈣化中心周圍肝細(xì)胞壞死形成一片均質(zhì)紅染無結(jié)構(gòu)的團(tuán)塊樣物質(zhì),偶見嗜堿性深染的崩解的細(xì)胞核碎片,外緣有數(shù)個(gè)細(xì)胞核排列在細(xì)胞周邊圍成馬蹄或圓形的多核巨細(xì)胞,胞漿豐富呈淺粉色(見中插彩版圖2C)。

2.1.2 腸道 低倍鏡可見十二指腸部分黏膜層上皮脫落,中央乳糜管周圍有炎性細(xì)胞聚集浸潤,局部有出血現(xiàn)象,十二指腸腺腺管偶見擴(kuò)張含有均質(zhì)粉染的分泌物,腺上皮細(xì)胞呈扁平狀(見中插彩版圖3A)?？漳c固有層增厚,出現(xiàn)輕度增生,黏膜下層的結(jié)締組織疏松水腫(見中插彩版圖3B)。盲腸有輕度充血,固有層與腸絨毛脫離,結(jié)締組織疏松水腫并伴有炎性細(xì)胞聚集形成炎性灶(見中插彩版圖3C)。

高倍鏡可觀察到十二指腸炎性細(xì)胞主要是淋巴樣細(xì)胞,細(xì)胞核呈圓形、藍(lán)染,胞漿較少,其次是嗜中性粒細(xì)胞,胞漿飽滿嗜酸性染色,含有分葉狀細(xì)胞核。固有層中含有黃褐色的含鐵血黃素,有出血(見中插彩版圖4A)?？漳c李氏隱窩間的結(jié)締組織疏松、水腫(見中插彩版圖4B)。

十二指腸偶見炎性細(xì)胞聚集,主要是淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞,毛細(xì)血管充血。盲腸腸腺的潘氏細(xì)胞數(shù)量增多,可觀察到圓而深染嗜堿性且?guī)缀鯚o細(xì)胞質(zhì)的淋巴樣細(xì)胞和細(xì)胞核為分葉狀的嗜中性粒細(xì)胞(見中插彩版圖4C)。

3 討論

本試驗(yàn)采用滴鼻吸入的方式,采集消化系統(tǒng)中肝臟和腸道,觀察牛分支桿菌對(duì)肝和腸道的影響。病理組織學(xué)觀察中發(fā)現(xiàn)肝臟出現(xiàn)典型肉芽腫結(jié)節(jié),中心為鈣化中心,包裹于壞死組織中,外周炎性細(xì)胞浸潤并含有多核巨噬細(xì)胞,還發(fā)現(xiàn)小葉間的結(jié)締組織疏松水腫并增生,小葉尤其是中央靜脈周圍出現(xiàn)淋巴樣細(xì)胞炎性灶,這與程廣宇[4]、壬大孝[5]等人的文獻(xiàn)一致。在之前的文獻(xiàn)報(bào)道中,鮮有報(bào)道牛分枝桿菌對(duì)于腸道的影響,本文的結(jié)果發(fā)現(xiàn),其對(duì)消化道的損傷沒有形成明顯的肉芽腫,僅有多個(gè)聚集的炎性灶,結(jié)締組織的增生等。Domingo M.[6]等人的研究顯示,臟器出現(xiàn)可觀察到的或典型結(jié)核病變通常與病畜的感染途徑有關(guān),如果通過飲食,經(jīng)消化道感染,則可能在感染動(dòng)物的腸系膜淋巴結(jié)中造成損傷,但很少或幾乎不會(huì)在腸壁上看到損傷。腸道的結(jié)核主要見于人結(jié)核分支桿菌對(duì)于人回盲部的影響,分為潰瘍型、增生型和混合型。本研究使用牛分枝桿菌通過鼻腔吸入的方式觀察肝臟和腸道的損傷,因未進(jìn)行牛分枝桿菌的分離培養(yǎng)或者標(biāo)志性檢測(cè)確診,這種肉芽腫是否是結(jié)核特異型還是普通的炎癥反應(yīng)還需要進(jìn)一步證實(shí)。

經(jīng)牛分枝桿菌感染部位,引發(fā)細(xì)胞和體液免疫,聚集大量的免疫細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞。曾經(jīng)人們一度以為肉芽腫可以抑制結(jié)核菌的生長增殖,然而隨著研究深入,大家的看法有些改變。牛分支桿菌的免疫反應(yīng)缺陷和躲避免疫的毒性機(jī)制可使其被巨噬細(xì)胞吞噬,存活于其中并繁殖,形成潛伏性感染[7]。當(dāng)自身抵抗力變?nèi)鯐r(shí),分支桿菌會(huì)再次增殖。巨噬細(xì)胞在肉芽腫形成的早期,主要為M1型極化,促進(jìn)肉芽腫的形成并保護(hù)宿主,然而在以后的過程中逐步向M2型極化轉(zhuǎn)變,結(jié)核肉芽腫所在微環(huán)境炎癥狀態(tài)也有微妙變化,使得肉芽腫保護(hù)宿主的作用減小。這種極化的改變對(duì)于結(jié)核分支桿菌的潛伏感染起到正向作用,提高宿主的敏感性和發(fā)病率[8]?？傊?宿主感染牛結(jié)核分支桿菌后自身的免疫反應(yīng)呈雙面性,一方面保護(hù)宿主形成肉芽腫,限制病原體擴(kuò)散,另一方面該菌通過自身躲避機(jī)制,利用宿主的免疫細(xì)胞進(jìn)行生長增殖。