伍維高,鐘金鳳

(湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院,湖南 衡陽 421005)

近幾年來,動(dòng)物疫病肆意流行,免疫接種成為預(yù)防傳染病的有效措施之一,而免疫反應(yīng)過程相當(dāng)復(fù)雜,諸多因素會(huì)影響接種效果,如免疫抑制性疾病、不良的飼養(yǎng)環(huán)境、微量元素和蛋白質(zhì)的缺乏等,常導(dǎo)致免疫接種失敗,給生產(chǎn)帶來不可挽回的重大損失。為提高機(jī)體抗病力,增強(qiáng)動(dòng)物免疫力,免疫增強(qiáng)劑得以廣泛運(yùn)用。為了進(jìn)一步研究此類制劑,人為構(gòu)建免疫抑制模型的研究手段得到了諸多研究者的青睞。而環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX),以其誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生免疫抑制作用效果顯著,且成本低廉,越來越廣泛地運(yùn)用到制備動(dòng)物免疫抑制模型中。為此,本文對(duì)環(huán)磷酰胺構(gòu)建免疫抑制模型進(jìn)行綜述。

1 環(huán)磷酰胺的藥理作用

經(jīng)口服或靜脈注射的環(huán)磷酰胺主要在肝臟進(jìn)行代謝,生成低毒性的4-羥基環(huán)磷酰胺和醛磷酰胺,分布全身,進(jìn)一步降解為磷酰氮芥、丙烯醛和去甲氮芥,結(jié)合于快速生長(zhǎng)細(xì)胞的DNA上,產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性。極少部分可進(jìn)一步氧化成4-酮環(huán)磷酰胺和羧基環(huán)磷酰胺,無毒性,隨尿排出[1]。

2 CTX免疫抑制機(jī)理

2.1 環(huán)磷酰胺對(duì)免疫基因的影響

2.1.1 抑制抗菌蛋白基因表達(dá) 內(nèi)源性抗菌蛋白是天然免疫的重要組成部分,其中殺菌/滲透增強(qiáng)蛋白(Bactericidal/permeability increasing protein,BPI)、防御素(Defensins,DF)以及血小板型磷脂酶A2(Phospholipase A2,PLA2)備受關(guān)注[2]。大鼠連續(xù)5 d腹腔注射環(huán)磷酰胺40 mg/kg·bw,對(duì)照組注射等體積生理鹽水,結(jié)果顯示,對(duì)照組大鼠的睪丸、附睪、胸腺、肝、小腸、大腸6種器官均表達(dá)BPI、β-DF-1、血小板型PLA2;而環(huán)磷酰胺組胸腺、肝無BPI表達(dá),睪丸、胸腺、肝無β-DF-1表達(dá),睪丸、胸腺無血小板型PLA2表達(dá),其他有表達(dá)的組織中其含量比對(duì)照組低[3],試驗(yàn)提示,環(huán)磷酰胺可抑制體內(nèi)抗菌蛋白基因表達(dá)。

2.1.2 影響免疫相關(guān)基因的表達(dá) 環(huán)磷酰胺對(duì)免疫相關(guān)基因有一定影響。經(jīng)環(huán)磷酰胺處理的荷瘤鼠脾臟、骨髓和血漿相關(guān)多種免疫調(diào)節(jié)因子基因上調(diào),包括危險(xiǎn)信號(hào)、模式識(shí)別受體、炎癥介質(zhì)、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子和趨化因子受體[4]。通過基因芯片技術(shù)檢測(cè)環(huán)磷酰胺干預(yù)的胚胎干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)：自體免疫激活和移植排斥相關(guān)基因如CD3、CD28、CTLA4、MHC II、PRF1、GZMB 和 IL-2R 基因下調(diào),而免疫相關(guān)受體基因如IL1R2、IL18R1和FLT3上調(diào)[5]。

2.2 環(huán)磷酰胺對(duì)動(dòng)物轉(zhuǎn)錄水平的影響

2.2.1 抑制骨髓細(xì)胞相關(guān)mRNA表達(dá) 環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)骨髓抑制,造成骨髓細(xì)胞(BM)降低。雄性昆明種小鼠連續(xù)3d腹腔注射150 mg/kg·d環(huán)磷酰胺,7 d后采骨髓細(xì)胞通過Real time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),試驗(yàn)組BM細(xì)胞鈣敏感受體(Calcium-sensing receptor,CaSR)和絲裂素活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)mRNA水平極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01),引起B(yǎng)M造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、分化和動(dòng)員產(chǎn)生明顯障礙[6]。

2.2.2 調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)mRNA表達(dá) 環(huán)磷酰胺對(duì)細(xì)胞凋亡的影響主要體現(xiàn)在兩方面：增加促凋亡基因mRNA表達(dá)而抑制抗凋亡基因mRNA表達(dá),從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。SPF級(jí)NIH雄性小鼠于試驗(yàn)期第9、11、13天腹腔注射環(huán)磷酰胺 10 mg/kg,于 14 d、28 d取脾臟采用半定量RT-PCR檢測(cè)促凋亡基因-Caspase-9 mRNA和抗凋亡基因-B淋巴細(xì)胞基因2(B-cell lymphonma gene 2,BCL-2)的表達(dá),兩次結(jié)果均顯示,模型組Caspase-9 mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著升高而BCL-2 mRNA表達(dá)顯著降低[7]。8～12周遠(yuǎn)交系昆明種小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg/kg,1次/d,連續(xù)3 d,第10天取小鼠脾臟測(cè)定凋亡相關(guān)基因,結(jié)果顯示,BAX(Bcl-2 associated X protein)mRNA表達(dá)水平明顯上升,而BCL-2 mRNA表達(dá)明顯下降[8]。

2.2.3 降低免疫相關(guān)受體mRNA表達(dá) 環(huán)磷酰胺可降低免疫相關(guān)受體mRNA的表達(dá)。樹突狀細(xì)胞相關(guān)C-型凝集素-1(Dectin-1)和Toll樣受體(Tolllike receptor,TLR)主要表達(dá)在免疫細(xì)胞上,為免疫相關(guān)受體,與免疫狀態(tài)有關(guān)[9]。給予150 mg/kg環(huán)磷酰胺的BALB/c小鼠與第4、7、9天取肺組織測(cè)定Dectin-1 mRNA,結(jié)果顯示,在第4、7天肺組織Dectin-1 mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯下降(P＜0.05)[10]。24只昆明種小鼠(雌性)腹腔注射環(huán)磷酰胺150 mg/kg,4 h后肺泡巨噬細(xì)胞TLR2 mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比極顯著下降(P＜0.01);8 h后TLR4 mRNA表達(dá)極顯著降低(P＜0.01)[11]。

2.2.4 影響免疫因子mRNA表達(dá) 環(huán)磷酰胺對(duì)Th1、Th2類細(xì)胞因子mRNA表達(dá)均有不同程度影響。汪禎等[12]用SPF級(jí)昆明種小鼠按50 mg/kg·bw劑量隔日腹腔注射環(huán)磷酰胺,共7次,14 d后,無菌取脾臟測(cè)定IL-2 mRNA、IL-10 mRNA,結(jié)果顯示,IL-2 mRNA、IL-10 mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著下降;易有金等[13]腹腔注射40mg/kg·d環(huán)磷酰胺,結(jié)果顯示,脾臟和胸腺中 IL-2、IL-10、IL-12、IL-4、TNF-α和IFN-γ mRNA的表達(dá)量降低,以上試驗(yàn)提示,環(huán)磷酰胺對(duì)Th1、Th2類細(xì)胞因子表達(dá)均呈現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象[14]。

2.3 環(huán)磷酰胺對(duì)動(dòng)物蛋白水平的影響

2.3.1 抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá) 環(huán)磷酰胺降低著絲粒蛋白B(Centromere Protein,CenpB),CenpB是染色體著絲粒/動(dòng)粒復(fù)合體上一種最重要的功能蛋白,其特異性結(jié)合位點(diǎn)位于著絲粒 α1-衛(wèi)星DNA上17 bp的CenpB盒,參與著絲粒異染色質(zhì)的形成,環(huán)磷酰胺可致CenpB蛋白含量異常,致細(xì)胞無法正常分裂。昆明種小鼠連續(xù)7 d腹腔注射50 mg/kg·bw環(huán)磷酰胺,5 d后取血通過Western Blotting方法檢測(cè) CenpB蛋白,其含量顯著低于對(duì)照組[15]。

2.3.2 增加細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 環(huán)磷酰胺可通過增加細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)影響Fas/Fas L系統(tǒng)介導(dǎo)的凋亡蛋白。SPF級(jí)ICR純種雄性小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg/kg·bw,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Fas抗原(CD95)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的蛋白,其表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著升高[16]。人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株Jurkat加入環(huán)磷酰胺 3 mg/L,于12、24、48 h 收取細(xì)胞,Western Blot檢測(cè)FasL(Fas ligand,fas配體)和FADD(Floationg Point Addition,胞漿死亡信號(hào)銜接蛋白)表達(dá),結(jié)果表明,未處理的細(xì)胞無 FasL和FADD表達(dá),而環(huán)磷酰胺處理組表達(dá)FasL和FADD,且表達(dá)水平隨環(huán)磷酰胺刺激時(shí)間延長(zhǎng)而增加[17]。除此,環(huán)磷酰胺能顯著誘導(dǎo)Fas/Fas L下游蛋白Caspases產(chǎn)生[18],使凋亡不可逆進(jìn)行。

3 環(huán)磷酰胺在動(dòng)物上的應(yīng)用

因環(huán)磷酰胺主要作用于快速生長(zhǎng)細(xì)胞的DNA,并能從基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白表達(dá)等多方面產(chǎn)生細(xì)胞毒性。免疫細(xì)胞屬于快速生長(zhǎng)細(xì)胞,因此,環(huán)磷酰胺對(duì)免疫系統(tǒng)影響甚大,故可用環(huán)磷酰胺作為免疫抑制劑構(gòu)建免疫抑制模型,這是環(huán)磷酰胺在動(dòng)物上的主要用途。

3.1 環(huán)磷酰胺抑制動(dòng)物免疫器官 在環(huán)磷酰胺作用下雞表現(xiàn)出形態(tài)退行性改變,包括腔上囊囊泡不發(fā)達(dá),即腔上囊初級(jí)濾泡嚴(yán)重萎縮,皮質(zhì)和髓質(zhì)間隔不明顯且濾泡間結(jié)締組織嚴(yán)重增值[19]。Marsh J研究發(fā)現(xiàn),脾臟內(nèi)正常橢球相關(guān)細(xì)胞在環(huán)磷酰胺作用后1周變?yōu)榭张輀20]。

3.2 環(huán)磷酰胺降低動(dòng)物免疫細(xì)胞數(shù)量 連續(xù)3 d給7～8周齡雌性尼古拉斯火雞注射環(huán)磷酰胺(0～100 mg/kg·bw),測(cè)定血液學(xué)指標(biāo)發(fā)現(xiàn),環(huán)磷酰胺在初始注射后24～72 h引起明顯的白細(xì)胞減少、淋巴細(xì)胞減少、血小板減少和白細(xì)胞減少。但對(duì)單核細(xì)胞循環(huán)數(shù)、細(xì)胞體積、血漿蛋白無明顯影響。同時(shí),無法確定對(duì)嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的變化,因?yàn)樗鼈冊(cè)跈C(jī)體內(nèi)的數(shù)量微量[21]。

3.3 環(huán)磷酰胺減少免疫分子產(chǎn)生 研究表明,環(huán)磷酰胺可減少免疫分子產(chǎn)生：用80 mg/kg·bw環(huán)磷酰胺腹腔注射小鼠,同位素標(biāo)記法顯示24 h和48 h其腸道蛋白損失顯著高于對(duì)照組,連續(xù)2 d注射環(huán)磷酰胺(50 mg/kg·bw),可造成腸黏膜SIgA損傷,腸道固有層IgA表達(dá)量減少[22]。環(huán)磷酰胺(10 mg/kg·bw)與單劑量長(zhǎng)春新堿(0.025 mg/kg·bw,靜脈注射)和單劑量的 L-天冬酰胺酶(400 IU/kg·bw,靜脈注射)同時(shí)注射狗,3 d后抗體反應(yīng)受抑制[23]。

環(huán)磷酰胺在抑制免疫系統(tǒng)的同時(shí),其他新陳代謝旺盛的組織如胃腸、毛發(fā)等亦會(huì)受影響,因此,用環(huán)磷酰胺造模的同時(shí),動(dòng)物可出現(xiàn)采食量降低、生長(zhǎng)性能受阻、毛發(fā)脫落等現(xiàn)象[24-25]。

4 小結(jié)

環(huán)磷酰胺主要作用快速生長(zhǎng)細(xì)胞DNA,并從基因水平、轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平影響免疫系統(tǒng),它可下調(diào)抗菌蛋白基因、免疫相關(guān)基因的表達(dá),增加促凋亡基因mRNA和抑制抗凋亡基因mRNA轉(zhuǎn)錄,降低著絲粒蛋白B含量,抑制細(xì)胞正常分裂;誘導(dǎo)促凋亡蛋白Caspases產(chǎn)生,促使凋亡不可逆進(jìn)行,從而廣泛引起細(xì)胞周期改變、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生,最終表現(xiàn)出免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子的現(xiàn)象,可廣泛應(yīng)用在動(dòng)物免疫抑制模型上。