董 浩,姜 萌,楊一鳴,張林波,張文慧

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林 長春 130118)

致病性細小病毒大多為單股DNA病毒[1],分類地位主要集中在細小病毒科,按國際病毒分類委員會(ICTV)編寫的分類報告,根據(jù)各種細小病毒侵染的宿主不同,可將細小病毒科分為兩個亞科,分別是侵染脊椎動物的細小病毒亞科(Parvovirinae)和侵染昆蟲等節(jié)肢動物的濃核病毒亞科(Densovirinae)[2]。近年來流行較為嚴重的犬、豬和鵝等細小病毒均具有很強的破壞力,傳統(tǒng)疫苗的控制較為有限,加大新型疫苗的研制刻不容緩。

病毒樣顆粒(VLPs)是一種不含有病原核酸,只通過病毒的一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白組成的空心顆粒[3]。其不能進行自我復(fù)制,只是在形態(tài)上與病毒相似,可以通過感染模式把抗原遞呈給免疫細胞,有效的誘導(dǎo)機體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫功能,產(chǎn)生保護作用。目前活病毒疫苗的主要不足就是安全性不能完全保證,因此對于傳染病的防護VLPs有著傳統(tǒng)疫苗不可比擬的優(yōu)勢。

1 VLPs的結(jié)構(gòu)及免疫機制

VLPs是通過病毒的1個或多個結(jié)構(gòu)蛋白裝配形成的具有一定規(guī)則(通常為二十面體或桿狀)的超分子結(jié)構(gòu),直徑在25 nm～100 nm之間。病毒的結(jié)構(gòu)蛋白與包膜的結(jié)構(gòu)特征決定了VLPs的免疫原性和抗原性。VLPs的特點是可以多層重復(fù)且高密度的把病原相關(guān)分子模式(PAMPs)展現(xiàn)出來,可以通過PAMPs激活固有免疫反應(yīng),被宿主細胞中的各種識別受體所識別,隨后刺激巨噬細胞、樹突狀細胞等抗原遞呈細胞進行抗原捕獲,最后遞呈給MHCⅡ類分子,激活一系列的免疫應(yīng)答。一些外源性VLPs仍保留與原始病毒相近的受體結(jié)合位點,可以通過交叉遞呈的方式通過MHCⅠ類途徑進行遞呈,使CD8+T細胞活化,實現(xiàn)CD8+T細胞介導(dǎo)的保護性免疫反應(yīng),這樣可以更容易清除細胞內(nèi)的病原體。另外,VLPs可通過交聯(lián)B細胞膜表面免疫球蛋白從而誘導(dǎo)B細胞反應(yīng),還可有效刺激CD4+T細胞的增殖和細胞毒性T細胞反應(yīng)。在某些情況下,VLPs可以直接激活B細胞受體和刺激T細胞非依賴性IgM反應(yīng)。因此,只需要低劑量的VLPs就可以使免疫系統(tǒng)激活保護反應(yīng),從而顯著的降低了疫苗的成本[4]。在疫苗安全方面,VLPs不含有病毒的核酸,從而消除了活病毒重現(xiàn)的風(fēng)險,不會造成具有活力的病毒傳播,疫苗也不存在毒力返祖、產(chǎn)生免疫缺陷等風(fēng)險。VLPs除了疫苗功能以外,還可以作為一種抗原遞呈載體,不同種的病毒結(jié)構(gòu)基因通過基因工程手段整合到一起形成病毒樣顆粒(VLPs),單個VLPs上嵌合多個免疫原性較低的可溶性抗原可以有效提高可溶性抗原的免疫原性。還可以,分別表達外源抗原和VLPs,然后通過化學(xué)方法以共價或非共價的方式將其偶聯(lián)至VLPs表面,也可以設(shè)計外源抗原的結(jié)合位點,這些抗原包括環(huán)肽、短肽等蛋白抗原以及半抗原、多糖等非蛋白抗原[5]。

2 細小病毒VLPs的研究現(xiàn)狀

目前,國內(nèi)外主要集中在以下細小病毒的VLPs研究：犬細小病毒(CPV)、豬細小病毒(PPV)、人細小病毒B19(B19)、鵝細小病毒(GPV)等病毒的研究。

2.1 犬細小病毒VLPs的研究進展 犬細小病毒是細小病毒科細小病毒屬成員,具有細小病毒屬病毒典型形態(tài)和結(jié)構(gòu)[6]。CPV可引起犬急性出血性腸炎和急性心肌炎,發(fā)病率和病死率高,對犬及狐等經(jīng)濟動物具有極大的危害。CPV是一類結(jié)構(gòu)簡單的線狀單鏈DNA病毒,形態(tài)呈六角形或圓形,等軸對稱的二十面體,直徑約為20 nm,衣殼蛋白無囊膜,不含脂質(zhì)或糖類[7]。

CPV VLPs的制備通常是利用病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2表達后組裝而獲得的。目前常用的表達體系主要分為真核表達體系和原核表達體系,真核包含昆蟲細胞表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng),而原核主要是大腸桿菌表達系統(tǒng)。目前比較成熟的CPV VLPs利用真核表達系統(tǒng)的為多,主要原因是真核系統(tǒng)有利于實現(xiàn)外源蛋白翻譯后的修飾和折疊,表達的重組VP2結(jié)構(gòu)蛋白具有天然的分子構(gòu)象,利于VLPs的形成。Feng[8]等利用CPV的VP2蛋白在桿狀病毒表達系統(tǒng)表達,并在昆蟲細胞和蛹中組裝成病毒樣顆粒。VLPs的電子顯微照片顯示,與野生型細小病毒相比,它們的大小和形態(tài)非常相似。同時,該學(xué)者又在小鼠和狗中研究了VLPs的免疫原性,結(jié)果表明,CPV-VLPs刺激細胞和體液免疫應(yīng)答。Xu[9]等利用小泛素樣修飾(SUMO)融合模序在大腸桿菌中表達CPV的整體天然VP2蛋白,在融合模序切割后,CPV VP2蛋白自組裝成VLPs,獲得的VLPs具有類似真實病毒衣殼的大小和形狀。免疫試驗結(jié)果表明,VLPs可以有效地誘導(dǎo)抗CPV特異性抗體和淋巴細胞增殖。另外,也有學(xué)者利用CPV VLPs作為生物載體來應(yīng)用,王斌[10]利用PCR的方法將犬細小病毒的衣殼蛋白VP2基因擴增鏈接到pSMK載體質(zhì)粒上,利用大腸桿菌表達系統(tǒng)得到可溶性的VP2蛋白,然后自組裝成病毒樣顆粒特性。在體外環(huán)境下,以VLP為原料將MPA修飾后的量子點MPA-QDs包裹進入病毒樣顆粒內(nèi)部,形成具有良好生物相容性,且無生物毒性的熒光復(fù)合物 CPV VLPs-QD。

2.2 豬細小病毒VLPs的研究進展 豬細小病毒所致的繁殖障礙是世界養(yǎng)豬業(yè)面臨的問題,一旦病毒侵入易感豬群,發(fā)病率非常之高。PPV是單股負鏈DNA病毒,無囊膜,病毒粒子大小22 nm～25 nm,由60個衣殼蛋白亞基組成,結(jié)構(gòu)呈二十面體等軸對稱[11]。PPV基因組大小約5.0 kb,末端約有120 bp～200 bp的回文結(jié)構(gòu)[12]。

PPV的VLPs制備也主要從結(jié)構(gòu)基因VP2表達蛋白入手,常用的表達體系主要包含酵母表達體系,比如Tamosiunas[13]等使用來自豬血清的病毒核酸提取物擴增編碼PPV主要衣殼蛋白VP2的基因,并將其插入到釀酒酵母表達質(zhì)粒中,重組PPV VP2蛋白在酵母中有效表達,純化后的PPV VP2蛋白的電子顯微鏡分析顯示病毒樣顆粒(VLP)自組裝。產(chǎn)生針對重組PPV VP2蛋白的9種單克隆抗體(MAb)。通過PPV感染細胞的免疫熒光分析證實了新產(chǎn)生的MAb的特異性。利用間接ELISA進行評估,結(jié)果表明,具有很高的靈敏度和特異度。另外也有通過桿狀病毒-昆蟲細胞表達體系進行組裝的,Antonis[14]等用桿狀病毒表達載體系統(tǒng)(BEVS)產(chǎn)生的由重組病毒樣顆粒(PPV-VLP)組成的針對豬細小病毒(PPV)的新型疫苗,測試其免疫原性和保護效力,結(jié)果表明,在礦物油佐劑中的亞微量的PPV-VLP的制劑在用作參考模型的豚鼠和目標物種豬中誘發(fā)高血清抗體滴度。再有,PPV VLPs可以與外源抗原嵌合,為開發(fā)預(yù)防和控制豬病的多聯(lián)苗提供了可能,陳楊[15]等采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將PPV VP2與豬偽狂犬病病毒DNA共轉(zhuǎn)染Vero細胞,重組病毒PRV SA215/VP2株,電鏡觀察表明,感染的Vero細胞中可同時觀察到PRV與PPV兩種類病毒樣顆粒,成功實現(xiàn)了利用PRV載體表達PPV VP2蛋白病毒樣顆粒。

2.3 人細小病毒B19 VLPs的研究進展 人細小病毒B19顆粒直徑為23 nm,無囊膜包裹,病毒基因組是由3 500個堿基組成的單鏈DNA,B19病毒在分子生物學(xué)上有獨特性,末端回文序列長達365個堿基,G、C含量高,使得B19病毒二級結(jié)構(gòu)牢固,而不易克隆入細菌中。B19病毒同其他小DNA病毒一樣有種屬特異性。有兩種殼蛋白：VP1(83 kDa)和VP2(58 kDa),VP2占優(yōu)勢,VP1位于殼體外部,易與抗體結(jié)合。

B19病毒的組裝既可以在真核表達體系中完成,也可以在原核表達體系中完成。鄒小輝[16]等采用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng),成功制備了人細小病毒B19病毒樣顆粒,在透射電鏡下可見直徑約22 nm的VLPs。Sanchez-Rodriguez[17]等報道了在大腸桿菌中表達的重組VP2蛋白的B19 VLP的體外自組裝以及pH值和離子強度對組裝過程的影響,研究結(jié)果表明,VP2能夠在體外完全形成VLP。在中性pH值下,均勻的VLPs在酸性和堿性pH值下組裝,離子強度低,主要組件是小型中間體。體外自組裝的VLPs在37℃下是高度穩(wěn)定的,并且在80℃下30分鐘后,大部分顆粒保持組裝。B19病毒也被用來作為異源DNA的載體,在藥物和其他生物分子醫(yī)學(xué)成像中有著很大的應(yīng)用前景,Sanchez-Rodriguez[18]等將不同大小的異源線性dsDNA片段封裝到B19 V-VP2 VLP中的,其中將DNA和變性VP2蛋白共孵育,并通過一次透析步驟進行裝配過程,開啟了使用這種VLP作為具有未來治療應(yīng)用傳遞系統(tǒng)的可能性。

2.4 鵝細小病毒VLPs的研究進展 鵝細小病毒GPV直徑20～22 nm、無囊膜、二十面體對稱的病毒,在分類學(xué)上屬于細小病毒科(Parvoviridae),細小病毒亞科(Parvovirinae),依賴病毒屬(Dependovirus)的成員,GPV基因組全長約為5.2 kb,為單鏈、線性DNA。GPV基因組的一大特點是正負鏈DNA分子都具有回文序列。GPV總共編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白,分別是VP1、VP2和VP3。

GPV的VLPs的獲得多采用真核表達體系。Ju.H[19]等通過PCR擴增了GPV VP的基因,并使用桿狀病毒表達系統(tǒng)在昆蟲細胞中表達重組VPs蛋白,電子顯微鏡顯示在昆蟲細胞中自發(fā)組裝成VLPs,免疫實驗也證明獲得的VLPs具有較好的免疫原性。Chen.Z[20]等將野生型VP2密碼子轉(zhuǎn)化為在昆蟲基因中更常見的密碼子,使用桿狀病毒表達系統(tǒng)(BES)表達GPV的主要衣殼蛋白VP2組裝成病毒樣顆粒(VLP)。透射電鏡結(jié)果顯示VLP的形成,免疫原性測定結(jié)果顯示,VLP是高度免疫原性的,引起高水平的中和抗體并提供針對致死性攻擊的保護。

3 展望

細小病毒的VLPs主要由病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP2自組裝備成的不含遺傳物質(zhì)的空心顆粒,由于沒有DNA,病毒無法復(fù)制和增殖,也就不具備感染致病的能力,因此安全性也是傳統(tǒng)的活疫苗和弱毒苗所不能比擬的。另外由于VLPs可以出色的模擬病毒粒子的結(jié)構(gòu),與天然病毒具有相同的免疫原性,可以刺激機體產(chǎn)生持久的免疫反應(yīng)。因此VLPs作為一種未來的新型疫苗是值得期待的。但目前在顆粒制備上也存在一些技術(shù)難題,不管是哪種表達體系,獲得VLPs的過程就較繁瑣,獲得率又很低,這阻礙了病毒樣顆粒疫苗向臨床試驗的轉(zhuǎn)化,因此開發(fā)新型的表達體系,探索影響表達系統(tǒng)VLPs組裝過程的影響因素,是目前最為重要的研究方向。此外,VLPs的生物載體特性也得到了很好的應(yīng)用,通過化學(xué)偶聯(lián)或者生物包被等方式把異源基因,藥物,量子點及納米顆粒等整合到VLPs上,為研究生物靶向治療和生物納米成像等方面提供材料。