胡光強(qiáng)， 余 錄， 杜 曦， 高小青， 秦大蓮， 余崇林

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種以記憶認(rèn)知功能障礙為主的漸進(jìn)性神經(jīng)退行性疾病。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，到2050年，用于AD預(yù)防和治療的年消費(fèi)將高達(dá)1.89萬億美元，給社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。AD有兩大病理特征，一是細(xì)胞外Aβ的異常聚集形成具有神經(jīng)毒性的老年斑;另一個(gè)是細(xì)胞內(nèi)tau蛋白的過度磷酸化形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，加速AD進(jìn)程。其中，Aβ病理級(jí)聯(lián)假說是AD形成和發(fā)展的主軸，因此，尋找特異性與Aβ結(jié)合的藥物并探索其機(jī)制是治療AD的良好策略。

油橄欖是一種木犀科、齊墩果屬常綠喬木，廣泛種植于我國甘肅和四川。油橄欖果的食用和藥用價(jià)值極高，并已被熟知和應(yīng)用。然而，橄欖葉的開發(fā)價(jià)值卻長(zhǎng)期被忽視。橄欖葉中有一種主要的酚類化合物，即橄欖苦苷(Oleuropein,OE)，其含量豐富且易于分離和純化[2]。橄欖苦苷有多種藥理作用，包括抗癌、抗氧化、增強(qiáng)免疫等[3～5]，并且在神經(jīng)系統(tǒng)的作用也逐漸被關(guān)注。我們的前期研究也證明，橄欖苦苷能保護(hù)腦缺血再灌注損傷[6]。為證實(shí)橄欖苦苷在AD作用的可能效應(yīng)，我們首先檢測(cè)了橄欖苦苷對(duì)Aβ1-42纖維的抑制能力和親和效應(yīng)，并進(jìn)一步探討了其對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 材料 Neuro-2a細(xì)胞系(CCL-131,American cell type culture collection),橄欖苦苷(HPLC 98%)，購自成都曼思特生物科技有限公司(批號(hào)：MUST-14092511)。噻唑藍(lán)(MTT)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、硫生物素代磺色素(Th-T)，購自美國Sigma公司。Aβ1-42多肽購自蘇州強(qiáng)耀生物科技有限公司。 生物素(Thermo Scientific,美國)，SPR生物傳感器(Pall Fortebio，美國)。 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)。酶標(biāo)儀(美國biotek公司)，流式細(xì)胞儀(美國BD FACS verse公司)生物分子相互作用儀(Pall Fortebio，美國)，奧林巴斯倒置顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 方 法

1.2.1 Aβ1-42纖維的制備 取1 mg Aβ1-42多肽粉末，用400 μl的六氟異丙醇(HFIP)將其溶解，超聲至溶液澄清，再均勻分裝至4個(gè)1.5 ml離心管，用氮?dú)鉁睾痛蹈桑缓蟮玫綗o色透明的Aβ肽膜，附著于管壁內(nèi)側(cè)，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，需要時(shí)溶解。

1.2.2 Th-T熒光檢測(cè) Th-T是一種熒光染料，能與淀粉樣纖維的β片層結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，因此成為測(cè)定Aβ纖維的經(jīng)典方法。Th-T用PBS溶解為20 μmol/L避光備用。Aβ1-42肽膜用含2%DMSO的PBS溶解，加入適量的橄欖苦苷，Aβ1-42終濃度為20 μmol/L，橄欖苦苷的終濃度分別為12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L，總體積為100 μl，置于37 ℃培養(yǎng)箱中連續(xù)孵育5 d。不加Aβ1-42和橄欖苦苷的溶液作為空白對(duì)照組，模型組不加入橄欖苦苷。在孵育的第5天，取10 μl該溶液，加入Th-T溶液190 μl，在波長(zhǎng)440 nm～490 nm處檢測(cè)其熒光值。

1.2.3 Aβ1-42的生物素化及固化 用DMSO將生物素溶解至10 mmol/L，取孵育后的200 μl的Aβ1-42 (100 μg)，按1∶0.5的摩爾比混合，室溫靜置反應(yīng)30 min，使其實(shí)現(xiàn)生物素化。將200 μl生物素化的Aβ1-42轉(zhuǎn)移至黑色不透明的96孔板，然后把預(yù)濕的生物傳感器插入溶液中，生物素化的蛋白固化于傳感片，通過生物分子相互作用儀檢測(cè)Aβ1-42生物素化的成功與否，標(biāo)記成功的Aβ1-42傳感器用于后續(xù)藥物親和力的檢測(cè)。

1.2.4 橄欖苦苷與Aβ1-42的親和力測(cè)定 將橄欖苦苷用PBS溶解成400 μmol/L，加入200 μl至96孔黑板，等比梯度稀釋成200 μmol/L、100 μmol/L至25 μmol/L 6個(gè)濃度，對(duì)照組加入等量的PBS。將建立成功的Aβ1-42傳感器插入另一含PBS的96孔板，預(yù)濕10 min。將兩板放入生物分子相互作用儀，設(shè)置洗脫、基線、親合、解離分別為120 s，6個(gè)濃度梯度循環(huán)。利用Forte Bio Da-ta Acquisition軟件實(shí)時(shí)收集分子相互作用的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，計(jì)算橄欖苦苷與Aβ1-42的親和力(KD)值。

1.2.5 Neuro-2a細(xì)胞的培養(yǎng) Neuro-2a細(xì)胞是一種小鼠來源神經(jīng)瘤母細(xì)胞,廣泛用于神經(jīng)疾病的體外研究。將凍存的Neuro-2a細(xì)胞從液氮中取出，并于37 ℃水浴復(fù)蘇，然后轉(zhuǎn)移至6 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)液為含10%的胎牛血清(FBS)和1%的親鏈霉素雙抗(PSG)的DMEM。將其吹打均勻，放置于5% CO2恒溫(37 ℃)細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 MTT檢測(cè) 用MTT檢測(cè)橄欖苦苷對(duì)Neuro-2a的細(xì)胞毒性以及其對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞的幸存率的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用PBS清洗，0.25%的胰酶消化1 min后，吸掉胰酶，加入培養(yǎng)基，吹打均勻，收集細(xì)胞，鏡下數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)，然后按4000個(gè)/孔(100 μl)種植于96孔板，4 w只加入空白的培養(yǎng)基。24 h后，按濃度梯度加入藥物，48 h加入MTT，繼續(xù)孵育6 h，加SDS過夜，次日于590～650 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度，觀察橄欖苦苷對(duì)Neuro-2a的細(xì)胞毒性。另外，觀察橄欖苦苷對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞的幸存率的影響，按10000個(gè)細(xì)胞/孔(100 μl)種96孔板，24 h后加入孵育的20 μmol/L的Aβ1-42，同時(shí)給予或不給于橄欖苦苷處理(分別為12.5 μmol/L、25 μmol/L以及50 μmol/L)，24 h后，加入MTT，同上檢測(cè)。

1.2.7 流式細(xì)胞分析細(xì)胞的凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，種植于6孔板，20萬個(gè)細(xì)胞/孔，實(shí)驗(yàn)分組如上，24 h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并在200倍光鏡下采圖。然后用PBS洗滌3次，胰酶消化，收集細(xì)胞，離心1500 rpm 3 min，吸去培養(yǎng)基，每個(gè)樣品用含2 μl的碘化丙錠和1 μl膜聯(lián)蛋白V的PBS 200 μl重懸，在室溫避光反應(yīng)15～20 min后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

2 結(jié) 果

2.1 橄欖苦苷抑制Aβ1-42纖維 20 μmol/L的Aβ1-42與Th-T混合反應(yīng)后的熒光值比單獨(dú)的Th-T溶液對(duì)照組高近一倍，而當(dāng)Aβ1-42與橄欖苦苷孵育后，其Th-T熒光值呈劑量依耐性地降低，與單獨(dú)的Aβ1-42相比較***P<0.001。結(jié)果表明12.5 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L的橄欖苦苷顯著抑制Aβ1-42纖維(見圖1)。

2.2 橄欖苦苷與Aβ1-42的親和力 運(yùn)用生物分子相互作用儀檢測(cè)目標(biāo)蛋白與小分子藥物的親和力是目前直接而先進(jìn)的藥物篩選手段。曲線圖所示(見圖2A)，橄欖苦苷從12.5 μmol/L到400 μmol/L與Aβ1-42結(jié)合呈現(xiàn)濃度梯度趨勢(shì)。為曲線擬合狀態(tài)(見圖2B)。穩(wěn)態(tài)分析結(jié)果顯示其平衡離解速率常數(shù)(KD)值為249 μmol/L，結(jié)合速率常數(shù)(Kon)為90.5，解離速率常數(shù)(Koff)為3.03，說明橄欖苦苷與Aβ1-42有較好的結(jié)合效果，具有較強(qiáng)的親和力。

2.3 橄欖苦苷的細(xì)胞毒性及對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞的幸存率的影響 MTT結(jié)果顯示，橄欖苦苷從3.125 μmol/L到400 μmol/L對(duì)Neuro-2a有極小的毒性，并且在高劑量顯示具有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用。選取12.5 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L的橄欖苦苷對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，鏡下觀察結(jié)果顯示，Aβ1-42導(dǎo)致Neuro-2a細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，不規(guī)則，并且細(xì)胞間隙稀疏，表明有細(xì)胞死亡。橄欖苦苷對(duì)損傷的細(xì)胞形態(tài)有顯著的改善作用，并且提高Aβ1-42誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞的幸存率，與Aβ1-42相比較***P<0.001(見圖3A～C)。

2.4 橄欖苦苷對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞的凋亡的影響 流式結(jié)果分析表明，空白對(duì)照組僅有極少的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，凋亡率為(1.74±0.521)%；而Aβ1-42誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞有大量的細(xì)胞凋亡(36.13±4.14)%；橄欖苦苷低、中、高劑量處理的細(xì)胞，其凋亡率分別為(28.5±2.44)%、(14.24±2.30)%及(8.21±2.01)%。與單獨(dú)的Aβ1-42相比較*P<0.05或***P<0.001(見圖4A、B)。

圖1 橄欖苦苷對(duì)Aβ1-42纖維的抑制效應(yīng)

A：不同濃度的橄欖苦苷與Aβ1-42動(dòng)態(tài)結(jié)合和解離圖；B：橄欖苦苷與Aβ1-42結(jié)合的穩(wěn)態(tài)分析曲線擬合

圖2 橄欖苦苷與Aβ1-42的親和力

A：橄欖苦苷的細(xì)胞毒性；B：橄欖苦苷對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞的幸存率的影響；C：各組細(xì)胞形態(tài)變化

圖3 橄欖苦苷的細(xì)胞毒性及對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞的幸存率的影響

A：各組流式細(xì)胞圖；B：橄欖苦苷降低Aβ1-42誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞的凋亡率

圖4 橄欖苦苷對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞凋亡的影響

3 討 論

在阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展過程中，β淀粉樣蛋白一直是發(fā)病機(jī)制的主流學(xué)說。新近的研究顯示，在AD患者出現(xiàn)癥狀的二十幾年前，患者的大腦中已開始出現(xiàn)Aβ的聚集[7]，這也是諸多針對(duì)Aβ靶點(diǎn)的藥物在臨床試驗(yàn)失敗的一大因素，但也同時(shí)更加說明Aβ在AD的預(yù)防和治療中的重要性。Aβ的聚集激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞，影響軸突重塑；引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧自由基釋放，促使線粒體損傷，繼而引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生；促進(jìn)tau蛋白的磷酸化，使神經(jīng)纖維纏結(jié)形成，導(dǎo)致神經(jīng)元的丟失。諸多損傷因素形成復(fù)雜的瀑布式級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使患者最終出現(xiàn)記憶功能損傷[8,9]。

Aβ是淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)依次經(jīng)β-分解酶和γ-分解酶水解而形成的一個(gè)多肽家族。APP另一非Aβ途徑為sAPPα，由α分解酶作用產(chǎn)生。研究表明，橄欖苦苷能夠抑制tau纖維的形成[10]，并且促進(jìn)APP的α分解酶途徑從而可能減少Aβ的產(chǎn)生[11]。這為我們的實(shí)驗(yàn)提供了理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。Aβ多肽家族中，Aβ1-42最易聚集且最具毒性，在AD患者腦中含量較高[12]，因此被作為AD模型的首選。Aβ聚合有多種形式，包括單聚體、多聚體、纖維等，Th-T作為測(cè)定Aβ纖維的經(jīng)典方法，已被廣發(fā)運(yùn)用于針對(duì)Aβ靶點(diǎn)的藥物篩選[13,14]。因此，本實(shí)驗(yàn)以Aβ1-42為靶點(diǎn)，通過傳統(tǒng)的Th-T熒光測(cè)定證明橄欖苦苷具有降解Aβ纖維的能力。生物膜層干涉(biolayer interferometry,BLI) 技術(shù)是一種基于光干涉原理的非標(biāo)記技術(shù)，通過該技術(shù)計(jì)算出分子間的親和力，從而確認(rèn)分子間的相互作用。該技術(shù)操作簡(jiǎn)單、所需樣品量少、具有實(shí)時(shí)提供被分析物的相互作用等優(yōu)勢(shì)[15]，因此被廣泛用于蛋白與小分子親和力的測(cè)定以及抗體篩選等。本實(shí)驗(yàn)通過該技術(shù)進(jìn)一步確認(rèn)了橄欖苦苷與Aβ1-42有良好的親和力，明確橄欖苦苷作為抗Aβ藥物的可能性。在此基礎(chǔ)上，我們發(fā)現(xiàn)橄欖苦苷能夠降低Aβ1-42誘導(dǎo)的Neuro-2a的細(xì)胞毒性，提高細(xì)胞幸存率，并保護(hù)Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步驗(yàn)證了橄欖苦苷在AD治療的潛在可能性。

總之，我們目前的研究支持橄欖苦苷作為治療阿爾茨海默病的潛在藥物。這是對(duì)橄欖葉天然成分的新的探索，并將有助于廢物的循環(huán)利用。然而橄欖苦苷在AD治療的機(jī)制有待進(jìn)一步探索。