董 樂， 吳月娟， 黃 琪， 廖宇晗， 韋 雷， 吳 原

髓鞘由蛋白質(zhì)層和磷脂層構(gòu)成，髓鞘堿性蛋白(MBP)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)髓鞘的主要蛋白質(zhì)，位于髓鞘漿膜面，維持CNS髓鞘結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定，具有神經(jīng)組織特異性[1]。研究表明少突膠質(zhì)細(xì)胞(oligodendrocytes，OLs)缺失是脫髓鞘疾病的核心機(jī)制[2,3]。OLs起源于胚胎發(fā)育的早期階段，主要位于側(cè)腦室(LV)、第四腦室的室下區(qū)(SVz)和脊髓神經(jīng)管腹側(cè)[4,5]。人們認(rèn)為線粒體功能障礙和細(xì)胞凋亡可能在脫髓鞘過程中發(fā)揮更大的作用[6]，消旋-3-正丁基苯酞(dl-3-n-Butylphthalide，NBP)可改善脫髓鞘的癥狀[7]?？赡艿臋C(jī)制是通過抗細(xì)胞凋亡作用保護(hù)髓鞘[8]。本研究通過注射溴化乙錠(ethidium bromide，EB)至SD大鼠側(cè)腦室中制作脫髓鞘模型，給予NBP干預(yù)，觀察大鼠的脫髓鞘程度和病理學(xué)改變，探討NBP在脫髓鞘病變中的作用機(jī)制，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗動物及分組 正常成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠36只(9～10周齡，體重200～250 g，SPF級)，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。所有大鼠在室溫22 ℃～25 ℃的自然光照下進(jìn)行濕度控制的室內(nèi)飼養(yǎng)，并自由進(jìn)食和飲水。并隨機(jī)分為3組：EB組(n=12)、NBP組(n=12)和假手術(shù)組(n=12)。

1.1.2 主要試劑 兔抗鼠MBP多克隆抗體、兔抗鼠cytochrome C多克隆抗體、兔抗鼠caspase-9多克隆抗體購于美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗購于碧云天公司；胞漿蛋白抽提試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、免疫組織化學(xué)試劑盒、LFB髓鞘染色試劑盒、DAB顯色試劑盒購于索萊寶公司。

1.2 方 法

1.2.1 EB誘導(dǎo)脫髓鞘模型的建立 所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉，固定于立體定位儀。EB組和NBP組：用微量注射器以3 μl/min的速度把5 μl 濃度為0.05%的溴化乙錠溶液通過直接單次注射的方式注射至右側(cè)側(cè)腦室，并留針5 min以保證藥物充分彌散。具體坐標(biāo)為(AP=-0.6；ML=+1.3；DV=-3.8)。假手術(shù)組：通過相同的方法注射5 μl生理鹽水?？p合頭皮，復(fù)溫蘇醒后回籠飼養(yǎng)。NBP組中的大鼠以腹腔注射的方式給予NBP干預(yù)，劑量為20 mg/(kg·d)，EB組和假手術(shù)組以相同的方式注射相同量的生理鹽水。

1.2.2 動物取材和石蠟切片的制備 各組大鼠在14 d后用10%水合氯醛麻醉，打開胸腔暴露心臟，經(jīng)左心室快速灌注生理鹽水，后改用4%多聚甲醛灌注進(jìn)行前固定，然后斷頭取腦放于4%多聚甲醛進(jìn)行后固定。常規(guī)石蠟包埋，進(jìn)行3 μm連續(xù)冠狀位切片。

1.2.3 牢固藍(lán)(LFB)染色 常規(guī)脫蠟至水，95%酒精稍洗；Luxol Fast Blue染液室溫過夜，95%酒精清洗，蒸餾水沖洗，分化液分色15 s，蒸餾水沖洗，伊紅復(fù)染，蒸餾水沖洗，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察照相。通過脫髓鞘評分標(biāo)準(zhǔn)對各組大鼠進(jìn)行脫髓鞘評分：正常髓鞘結(jié)構(gòu)無脫髓鞘1分；輕度或輕度脫髓鞘(保留>50%髓磷脂染色)2分；重度脫髓鞘改變(髓鞘染色<50%保存)3分。記錄各組分值。

1.2.4 HE染色 切片常規(guī)脫蠟至水；蘇木素染色5 min，水洗10 min；1%鹽酸酒精30 s，水洗30 s；0.5%伊紅液染色3 min，蒸餾水洗30 s；酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察照相。

1.2.5 Tunel法 常規(guī)脫蠟至水，PBS洗；蛋白酶K工作液37 ℃孵育，PBS洗；Tunel 反應(yīng)混合液孵育，PBS洗；POD工作液孵育，PBS洗。DAB顯色，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察照相。選擇5個具有代表性的視野，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)和陰性細(xì)胞數(shù)，并計算陽性表達(dá)百分率[陽性表達(dá)百分率=陽性細(xì)胞數(shù)/(陽性細(xì)胞數(shù)+陰性細(xì)胞數(shù))×100%]。

1.2.6 免疫組織化學(xué)染色 常規(guī)脫蠟至水，PBS洗；0.3%H2O25 min，PBS沖洗后，放入檸檬酸緩沖液中進(jìn)行高壓抗原修復(fù)20 min，取出，室溫下自然冷卻至35 ℃以下，PBS洗；正常羊血清室溫10 min；兔抗鼠MBP多克隆抗體(1∶200)、兔抗鼠Cyt C多克隆抗體(1∶5000)、兔抗鼠caspase-9多克隆抗體(1∶500)室溫30 min、4 ℃冰箱過夜、室溫復(fù)溫30 min， PBS洗；二抗37 ℃孵育60 min， PBS洗；DAB顯色；酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察照相。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果用Image Pro plus圖像分析軟件測定積分光密度(integral optical density，IOD)值和陽性面積(area)。計算出各組平均光密度(IOD/area)并記錄。

1.2.7 Western blot 取腦白質(zhì)組織200 mg，依據(jù)胞漿蛋白抽提試劑盒說明書提取胞漿蛋白，煮沸變性，取50 μg蛋白，變性后行聚丙酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，TBST液洗3次，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST液洗3次，入兔抗鼠MBP(1∶500)或Cyt C抗體(1∶250)，4 ℃過夜，TBST液洗3次，加入辣根過氧化酶結(jié)合的抗兔IgG(1∶4000)，TBST液洗3次，ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測，X線片顯影。采用條帶圖像分析系統(tǒng)測定各條帶灰度值。并以Image J軟件進(jìn)行半定量分析，結(jié)果以相對光密度值×面積表示。蛋白的相對含量=目的蛋白條帶/β-tubulin條帶。記錄各組結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 髓鞘LFB染色結(jié)果 假手術(shù)組灰質(zhì)、白質(zhì)界限明顯，染色深且均勻，髓鞘結(jié)構(gòu)清晰、無脫失。與假手術(shù)組相比，EB組可見大小不等片狀髓鞘脫失，甚至出現(xiàn)大片的空泡變性脫失區(qū)域，NBP組藍(lán)色髓鞘區(qū)域相對完整，空泡變性區(qū)域相對減少(見圖1)；與假手術(shù)組相比，EB組的LFB脫髓鞘評分明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)；與EB組相比， LFB脫髓鞘評分明顯低于EB組P<0.05) (見圖2)。

2.2 HE染色結(jié)果 假手術(shù)組細(xì)胞排列整齊有序，組織排列致密，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，染色清晰；與假手術(shù)組相比，EB組組織排列紊亂，炎性細(xì)胞浸潤，白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散、破壞；NBP組的無明顯的結(jié)構(gòu)破壞，但結(jié)構(gòu)較假手術(shù)組松散，存在少量空泡(見圖1)。

2.3 Tunel 法染色結(jié)果 EB組可見大量凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯高于假手術(shù)組，NBP組凋亡細(xì)胞較EB組減少(見圖1)。與假手術(shù)組相比，EB組凋亡細(xì)胞陽性表達(dá)百分率高于假手術(shù)組(P<0.05)；與EB組相比，NBP組凋亡細(xì)胞陽性表達(dá)百分率明顯少于EB組(P<0.05)(見圖3)。

2.4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 與假手術(shù)組相比，EB組MBP表達(dá)量明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)；與EB組相比，NBP組MBP表達(dá)量明顯高于EB組(P<0.05)；與假手術(shù)組相比，EB組caspase-9表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)；與EB組相比，NBP組caspase-9表達(dá)量明顯低于EB組(P<0.05)(見圖4)。

2.5 Western blot結(jié)果 與假手術(shù)組相比，EB組MBP表達(dá)水平顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)；與EB組相比，NBP組MBP表達(dá)高于EB組(P<0.05)；與假手術(shù)組相比，EB組Cyt C表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；與EB組相比，NBP組Cyt C表達(dá)水平低于EB組(P<0.05) (見圖5)。

圖1 各組大鼠腦白質(zhì)區(qū)HE染色、LFB染色、TUNEL染色(10×40)

與假手術(shù)組相比*P<0.05；與EB組相比#P<0.05

圖2 LFB染色檢測各組大鼠腦白質(zhì)脫髓鞘程度

與假手術(shù)組相比*P<0.05；與EB組相比#P<0.05

圖3 TUNEL染色法檢測各組大鼠腦白質(zhì)陽性表達(dá)百分率

與假手術(shù)組相比*P<0.05；與EB組相比#P<0.05

圖4 免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠腦白質(zhì)MBP、Cyt C的表達(dá)(10×40)

與假手術(shù)組相比*P<0.05；與EB組相比#P<0.05

圖5 Western blot 法檢測各組大鼠腦白質(zhì)MBP、Cyt C的表達(dá)

3 討 論

EB誘導(dǎo)脫髓鞘模型是由Yajima和Suzuki在1979年研發(fā)出來，主要用于研究局灶性脫髓鞘疾病。既往研究發(fā)現(xiàn)，在2～4 w內(nèi)該模型可以在目的區(qū)域產(chǎn)生明顯脫髓鞘病變，并且可見OLs死亡。OLs和星形膠質(zhì)細(xì)胞丟失都是EB誘導(dǎo)脫髓鞘病變中心的標(biāo)志[9]。建立EB誘導(dǎo)脫髓鞘模型后72 h內(nèi)出現(xiàn)OLs死亡[10]。Mahdi Goudarzvand等指出EB具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[11]。證明這個模型的穩(wěn)定性。

MBP是特異性表達(dá)于髓鞘具有抗原性的蛋白質(zhì)，是髓鞘蛋白的主要成分[12]。主要分布在胼胝體、海馬、以及小腦和皮質(zhì)下區(qū)域。因此，MBP也被認(rèn)為是成熟髓鞘的標(biāo)志性蛋白[12]。只有成熟的OLs大量表達(dá)MBP，才有對軸突髓鞘化的能力[13]，脫髓鞘病變時，病變區(qū)髓鞘崩解脫失，組織結(jié)構(gòu)松散，炎性細(xì)胞浸潤， MBP表達(dá)減少。本實驗在EB側(cè)腦室注射后14 d， EB組出現(xiàn)髓鞘淡染，髓鞘崩解，髓鞘脫失；組織結(jié)構(gòu)松散，神經(jīng)纖維紊亂，炎性細(xì)胞浸潤，MBP表達(dá)減少。與EB組相比，NBP組髓鞘染色深染，髓鞘相對完整，髓鞘脫失減輕。組織結(jié)構(gòu)完整，纖維排列整齊，炎癥細(xì)胞減少。NBP組MBP表達(dá)增高，表明EB誘導(dǎo)CNS脫髓鞘模型建立成功，而且NBP能夠減輕組織脫髓鞘和炎癥反應(yīng)，保護(hù)髓鞘完整。

在CNS內(nèi)，正常的軸突運輸過程和神經(jīng)元存活依賴于適當(dāng)?shù)乃枨市纬蒣14]。有髓神經(jīng)纖維的髓鞘由OLs的突起形成。在脫髓鞘過程中存在大量OLs凋亡[15]，對12例因急性復(fù)發(fā)而死亡的MS患者早期病變形成的研究顯示，在沒有外周免疫細(xì)胞浸潤的情況下，病變包含廣泛的OLs凋亡[16]，因此，抑制OLs凋亡過程能夠有效減輕脫髓鞘程度。Cyt C是12.3 kDa，核DNA編碼的蛋白質(zhì)。在細(xì)胞質(zhì)中游離核糖體合成[17]。Cyt C正常時位于線粒體內(nèi)外膜之間，不能通過線粒體外膜進(jìn)入胞漿，脫髓鞘病變時，OLs線粒體功能障礙，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(PTP)開放[18]。持續(xù)的病理性PTP開放誘導(dǎo)胞質(zhì)流入線粒體基質(zhì)，導(dǎo)致線粒體膜電位的喪失和離子梯度的失衡，膜電位去極化促進(jìn)線粒體基質(zhì)擴(kuò)張，線粒體腫脹和膜破裂，導(dǎo)致Cyt C釋放[19]。Cyt C從線粒體釋放到胞質(zhì)，此為線粒體介導(dǎo)凋亡途徑的關(guān)鍵步驟，與Apaf 1、ATP/dATP結(jié)合形成凋亡體，Apaf 1通過分子中的胱天蛋白募集域(CARD)與caspase-9前體原域中的CARD相互作用而募集caspase-9前體，caspase-9前體自我激活后活化下游的caspase-3，引起OLs細(xì)胞凋亡[20]。EB組CNS存在大量細(xì)胞凋亡，而且Cyt C、caspase-9細(xì)胞質(zhì)表達(dá)明顯上調(diào)，這些都表明在EB誘導(dǎo)的CNS脫髓鞘模型中，存在OLs線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。與EB組相比，NBP組Cyt C、caspase-9表達(dá)減少，凋亡細(xì)胞明顯減少，表明NBP可以有效減少EB模型中Cyt C釋放，抑制caspase-9的表達(dá)，抑制OLs內(nèi)線粒體途徑凋亡途徑，維持OLs生理功能和髓鞘的完整。本實驗證實NBP對EB誘導(dǎo)的CNS脫髓鞘有保護(hù)作用?？赡芘c抑制OLs內(nèi)線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡有關(guān)。