董玲鳳，張靜雯，黃建洲，池霖生，陳棪焜，馬文敏

(南方醫(yī)科大學附屬佛山市婦幼保健院輔助生殖技術中心，佛山 528000)

胚胎玻璃化冷凍解凍技術由于其快速、簡便、損傷小、復蘇存活率高等優(yōu)勢迅速應用于輔助生殖領域中[1]。多項研究表明凍融胚胎移植(FET)成功率主要與胚胎質量、子宮內(nèi)膜準備、子宮內(nèi)膜與胚胎發(fā)育的同步性等主要因素有關[2-4]。如何合理把握胚胎“種植窗”提高解凍周期臨床妊娠率成為臨床醫(yī)生和胚胎學家關注的重點[5-8]。本研究回顧性分析激素替代周期(HRT)中胚胎解凍后不同的體外培養(yǎng)時間對移植周期臨床結局的影響。

一、資料與方法

1.研究對象及分組：收集本生殖中心2016年1月1日至2017年12月31日進行的270個FET周期為研究對象。納入標準：女方年齡≤35歲，首次解凍移植周期，內(nèi)膜準備采用HRT方案，移植兩枚解凍后卵裂球100%存活的優(yōu)質卵裂期(D3)胚胎。排除胚胎反復凍融的移植周期。

所有周期按照解凍后胚胎在體外培養(yǎng)時間的不同分為正常解凍組(168個周期)和提前解凍組(102個周期)。正常解凍組：第3天(D3)移植，移植當天早上8～9點解凍，解凍后D3胚胎體外培養(yǎng)2～3 h后移植，移植前0.5 h轉入移植液EmbryoGlue(Vtriolife，瑞典)中平衡；提前解凍組：D3胚胎于移植前1 d(D2)下午16～17點左右解凍，解凍后D3胚胎體外培養(yǎng)17～18 h，次日8～9點移植(D3)，移植前0.5 h轉入EmbryoGlue液中平衡。

2.主要儀器與試劑：胚胎培養(yǎng)箱(LABOTECT，德國)；倒置顯微鏡(奧林巴斯，日本)；體視顯微鏡(NIKON，日本)；IVF工作站(K-SYSTEMS，丹麥)；玻璃化冷凍套裝[含平衡液(ES)、?；?VS)]、玻璃化解凍套裝(含WS1、WS2、WS3、WS4四種液體)(OrigioMEDICULT，丹麥)；半封閉式載桿(cryotop，加藤，日本)；胚胎培養(yǎng)液IVF-PLUS、G1-PLUS、G2-PLUS、培養(yǎng)油及移植液EmbryoGlue(Vtriolife，瑞典)。

3.研究方法：促排方案的選擇、胚胎冷凍及解凍、胚胎移植等按照本中心常規(guī)程序進行。胚胎玻璃化冷凍方法：冷凍試劑ES、VS室溫平衡0.5 h后，將D3胚胎在200 μl的ES中平衡6～7 min，待其形態(tài)恢復后，在100 μl的VS中沖洗數(shù)次，胚胎裝入載桿，迅速投入液氮，胚胎在VS中的時間到投入液氮整個過程不超過1 min。胚胎玻璃化解凍方法：解凍試劑包括WS1、WS2、WS3及WS4四種液體，提前0.5 h取出1 ml WS1倒入雙凹皿中并置于無CO2、37℃培養(yǎng)箱中預溫，其余3種液體分別置于室溫下四孔板中復溫。解凍時，快速將含胚胎載桿段浸入37℃的WS1中，輕晃使胚胎落下，37℃放置1 min，隨后在WS2、WS3、WS4-1、WS4-2中分別平衡3 min，最后將胚胎轉入6%CO2過夜平衡的G2培養(yǎng)液中，記錄卵裂球損傷情況，進行胚胎評分后放置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱中。移植前0.5 h將G2內(nèi)的解凍胚胎轉移至胚胎膠中。

胚胎評分標準：本中心主要根據(jù)卵裂球數(shù)目、均一性及碎片率進行評分。記錄卵裂球個數(shù)；均一性分3級(1級：卵裂球大小均勻，形態(tài)規(guī)則；2級：大小略不均勻，形態(tài)略不規(guī)則；3級：大小明顯不均，可有明顯的形態(tài)不規(guī)則)；碎片分4級(1級：無碎片或碎片數(shù)量<5%；2級：碎片數(shù)量<20%；3級：碎片數(shù)量為20%～50%；4級：碎片數(shù)量>50%)。D3優(yōu)質胚胎標準：D3胚胎細胞數(shù)為7～9個，細胞均一性為1～2級，碎片1～2級。

HRT及胚胎移植：對于內(nèi)膜薄、反復排卵周期冷凍移植失敗、不明原因不孕癥、排卵障礙誘發(fā)排卵失敗、自然周期異常出血、自然周期排卵異常等患者采用HRT方案。具體流程：子宮內(nèi)膜厚度達到8 mm或以上時進行子宮內(nèi)膜轉化，72 h后移植。胚胎移植后第14天查尿HCG/β-HCG，確定是否妊娠。如陽性繼續(xù)用HCG或黃體酮至妊娠10～12周左右，胚胎移植28～35 d后行B超檢查，如妊娠囊中可探查到胎芽及搏動的胎心則為臨床妊娠。12周前的胚胎停育為早期流產(chǎn)。

4.統(tǒng)計學分析：采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料比較采用兩獨立樣本t檢驗，計數(shù)定性資料比較采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

二、結果

1.兩組一般資料比較：正常解凍組和提前解凍組的女方年齡、體重指數(shù)(BMI)、不孕年限、子宮內(nèi)膜厚度等基本資料比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

2.兩組患者臨床結局比較：提前解凍組的臨床妊娠率(58.82%)略高于正常解凍組(58.33%)，但無顯著性差異(P>0.05)；提前解凍組的胚胎種植率(38.73%)略低于正常解凍組(39.58%)，亦無顯著性差異(P>0.05)；提前解凍組的流產(chǎn)率(11.67%)有高于正常解凍組(9.18%)的趨勢，但兩者無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表1 兩組患者一般資料比較(-±s)

表2 兩組患者臨床結局比較(%)

三、討論

解凍后卵裂期胚胎延長體外培養(yǎng)時間能否提高解凍移植周期的臨床妊娠率，一直存在爭議。影響解凍卵裂期胚胎臨床妊娠率的原因很多，如女方年齡、不孕年限、子宮內(nèi)膜厚度、胚胎質量、內(nèi)膜準備方式、移植胚胎數(shù)及解凍后卵裂球損傷等[9-13]。在本研究中，限制研究對象為首次解凍移植周期、內(nèi)膜準備為HRT方案、女方年齡≤35歲的年輕不孕患者，排除了年齡、內(nèi)膜準備方式、FET重復失敗周期等的影響因素；只納入移植兩枚解凍后完整存活的優(yōu)質卵裂期胚胎的周期，排除了明顯冷凍損傷的卵裂球對胚胎種植率及臨床妊娠率等方面的影響，以盡量去除干擾因素，使結果更加客觀、準確。

本研究結果表明對于≤35周歲、HRT-FET移植2枚完整存活的優(yōu)質卵裂期胚胎的年輕不孕人群，延長體外培養(yǎng)時間并不能顯著提高其臨床妊娠率，提示胚胎質量對臨床妊娠結局有重要影響，解凍后卵裂球完好的優(yōu)質胚胎可能由于有較好的發(fā)育潛能，在體內(nèi)、外都有很強的適應能力，故不同解凍時間組的臨床結局無顯著性差異，這一結果與劉曉音等[14]在研究中提到延長體外培養(yǎng)時間并不顯著影響玻璃化凍融胚胎發(fā)育潛能的結論相似。羅金等[15]的研究也認為次日移植并不能提高臨床妊娠率和種植率，反而增加了流產(chǎn)率。本研究結果亦表明延長解凍胚胎的體外培養(yǎng)時間可能使早期流產(chǎn)率有增加趨勢，但目前尚無顯著性差異。之前有研究認為胚胎解凍后過夜培養(yǎng)，有卵裂球細胞生長的胚胎能夠獲得較高的種植率、妊娠率，生長為桑葚胚者能夠獲得較好的妊娠結局[9-13]，說明延長體外培養(yǎng)時間可能有利用選擇更好發(fā)育潛能的胚胎，提示我們對于質量較差或者細胞數(shù)較少的冷凍胚胎，可以選擇延長體外培養(yǎng)時間來進一步篩選有較好發(fā)育潛能的胚胎。

綜上所述，對于擁有凍融優(yōu)質卵裂期胚胎的年輕患者而言，延長解凍胚胎的體外培養(yǎng)時間并不能更加改善其臨床結局，提示我們在臨床工作中可靈活安排胚胎的解凍和移植時間。但由于本研究樣本量較小，研究結論可能存在一定的局限性，后續(xù)研究應擴大樣本量，完善研究設計后進一步加以探索。