林慧隆，沈來恩，林琪，邊曉麗，吳雪清

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，溫州 325000)

宮腔粘連(IUA)第一次是由德國(guó)的Fritsch在1894 年報(bào)道的，但在1948年，Asherman首次對(duì)該疾病進(jìn)行命名并作詳細(xì)描述，因此現(xiàn)在也稱之為Asherman綜合癥(AS)[1]。其主要是由于子宮內(nèi)膜基底層損傷后修復(fù)障礙而導(dǎo)致的宮腔部分或全部粘連閉塞，從而引起月經(jīng)異常、周期性腹痛、不孕及反復(fù)流產(chǎn)等臨床表現(xiàn)。從組織學(xué)角度來說，IUA就是內(nèi)膜基質(zhì)被纖維組織替代，腺體被不活躍的柱狀上皮替代，后者對(duì)激素刺激不敏感。最終子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致了子宮功能失常。在起初的50～60年，對(duì)宮腔粘連的研究主要集中在其流行病學(xué)、病因?qū)W和病理學(xué)。內(nèi)鏡技術(shù)的發(fā)展為其診斷和治療提供了新的手段，目前以宮腔鏡下粘連分解術(shù)并輔以雌激素治療作為標(biāo)準(zhǔn)治療手段[2]。Myers等[3]報(bào)道了一篇案例，12位重度宮腔粘連的女性在宮腔鏡粘連分解術(shù)后輔以雌激素、球囊支架、宮內(nèi)節(jié)育器(IUD)綜合治療后全部恢復(fù)了月經(jīng)周期，并且其中6人成功妊娠。但宮腔粘連術(shù)后總體復(fù)發(fā)率為 3.1%～23.5%，其中重度粘連高達(dá) 62.5%[4]。對(duì)于重度宮腔粘連子宮內(nèi)膜大面積損傷的情況下，雌激素很難達(dá)到有效的治療作用，因?yàn)榇萍に匕l(fā)揮作用必須在足夠殘留內(nèi)膜的基礎(chǔ)之上。而干細(xì)胞工程為宮腔粘連的治療開辟了一條新的道路，以往的研究已經(jīng)證明了其能通過促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生來治療宮腔粘連[5-7]。但是大樣本數(shù)據(jù)的缺乏使得無法形成標(biāo)準(zhǔn)化的干細(xì)胞治療方案。為普及宮腔粘連的干細(xì)胞治療，一系列的問題有待解決，比如干細(xì)胞來源問題、劑量選擇、用藥方式等。

一、宮腔粘連概述

子宮內(nèi)膜可以分為功能層和基底層。生理情況下，功能層在卵巢周期性的激素作用下可發(fā)生增生、分化及脫落，再由基底層按周期規(guī)律性再生成新的功能層。正常女性生育期可經(jīng)歷400多個(gè)這樣的周期，表明子宮內(nèi)膜具有再生能力以及較強(qiáng)的容受性。而病理狀態(tài)下，基底層修復(fù)功能受損時(shí)，子宮內(nèi)膜完整性被破壞，導(dǎo)致宮腔發(fā)生形態(tài)異常及纖維粘連的形成。其形成機(jī)制可能為雌激素受體減少、子宮內(nèi)膜干/祖細(xì)胞異常、細(xì)胞因子異常和血管形成障礙等幾方面共同作用[8]。

二、干細(xì)胞治療子宮內(nèi)膜效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)

為了解子宮內(nèi)膜修復(fù)效果，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)形成了一系列較為常用的檢查。其中包括病理形態(tài)學(xué)結(jié)果(如子宮內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜腺體數(shù)目、子宮內(nèi)膜小血管數(shù)目及纖維化面積比率等)、免疫熒光檢測(cè)(觀察經(jīng)標(biāo)記的干細(xì)胞在內(nèi)膜分布情況)、免疫組織化學(xué)檢測(cè)(如角蛋白、波形蛋白及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的檢測(cè)等)、IUA相關(guān)基因檢測(cè)以及子宮妊娠結(jié)局(如胚胎數(shù)目等)。

三、不同來源的干細(xì)胞治療宮腔粘連

(一)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)

1.臨床案例：國(guó)內(nèi)外案例報(bào)道主要集中在自體骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的移植治療上。Nagori等[5]的團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一例將自體提取的干細(xì)胞移植到子宮腔治療重癥宮腔粘連的患者，他們從該患者自身骨髓細(xì)胞中分離出39×106個(gè)CD9、CD40、CD90陽(yáng)性細(xì)胞移植至子宮腔，最終患者子宮內(nèi)膜增厚達(dá)到胚胎移植的標(biāo)準(zhǔn)，并通過體外受精-胚胎移植(IVF-ET)成功懷孕。而Singh等[6]則直接將(103.3±20.5)×106個(gè)單核干細(xì)胞(MNCs)直接移植到6名患者子宮內(nèi)膜下，而不是分離出特定表型的細(xì)胞再移植。結(jié)果顯示全部6名患者子宮內(nèi)膜厚度均較前增加，但未達(dá)到理想厚度，其中5名恢復(fù)了月經(jīng)。Santamaria等[7]從外周血中分離出CD133陽(yáng)性的骨髓來源干細(xì)胞，平均數(shù)量為124.39×106個(gè)，再通過導(dǎo)管自體移植到子宮螺旋動(dòng)脈中。經(jīng)過治療后，16個(gè)宮腔粘連及子宮內(nèi)膜萎縮患者中，15個(gè)恢復(fù)了月經(jīng)，其中1名患者成功經(jīng)陰道分娩足月兒，另一個(gè)則經(jīng)剖宮產(chǎn)分娩足月兒。國(guó)內(nèi)Zhao等[9]將攜帶骨髓來源單核細(xì)胞的膠原支架放置到子宮腔來治療10個(gè)重度宮腔粘連患者，移植的干細(xì)胞密度為5×106/cm2，最終有5名患者成功生育。以上臨床案例皆是通過宮腔內(nèi)移植干細(xì)胞來進(jìn)行治療，細(xì)胞數(shù)量、用藥途徑存在一定的差別，但宮腔粘連等損傷情況都在一定程度上得到改善。

2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：Liu等[10]利用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記BMDCs在子宮內(nèi)膜物理?yè)p傷后的C57BL/6J小鼠模型上進(jìn)行試驗(yàn)，分別通過靜脈血注射和宮腔局部注射的方式給予治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)全身用藥的小鼠子宮內(nèi)募集了更多的GFP陽(yáng)性的細(xì)胞。該實(shí)驗(yàn)表明全身用藥具有更好的的治療效果，至少在保持損傷部位干細(xì)胞濃度上具有一定優(yōu)勢(shì)，其可能原因在于靜脈較宮腔具有更有利于干細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境。但靜脈注射干細(xì)胞安全性及臨床可行性仍需要進(jìn)一步進(jìn)行探索。此外，該實(shí)驗(yàn)也提示了能從提高局部干細(xì)胞的活性和濃度的方面入手提高干細(xì)胞移植的治療效果，如Yang等[11]就發(fā)現(xiàn)，在體外實(shí)驗(yàn)中，維生素C(Vc)能促進(jìn)Pluronic F-127(PF-127)凝膠包裹的BMSCs的生存及生長(zhǎng)，并且在經(jīng)物理?yè)p傷誘導(dǎo)產(chǎn)生的宮腔粘連大鼠模型中證明了BMSCs、PF-127和Vc三者聯(lián)合治療能促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)，這表明Vc和PF-127能為BMSCs創(chuàng)造一個(gè)更有利的生存環(huán)境，提高其治療作用。而最近Ong等[12]指出并沒有證據(jù)表明BMDCs能轉(zhuǎn)化為子宮內(nèi)膜上皮、基質(zhì)細(xì)胞或者內(nèi)皮細(xì)胞，該團(tuán)隊(duì)利用更靈敏的檢測(cè)手段來檢測(cè)子宮內(nèi)膜的免疫細(xì)胞的表型，他們推測(cè)之前關(guān)于BMDCs能轉(zhuǎn)化為子宮內(nèi)膜細(xì)胞系的報(bào)道其實(shí)是錯(cuò)誤地識(shí)別了免疫細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)是顛覆性的，因?yàn)槿藗兤毡檎J(rèn)為BMDCs能直接促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生，基于此才形成了一系列針對(duì)損傷內(nèi)膜的治療方法。因此，明確這個(gè)問題非常重要，未來需要更多的關(guān)注該方面研究進(jìn)展。然而，不論是臨床還是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都表明BMDCs對(duì)于內(nèi)膜損傷具有一定的修復(fù)作用，且患者癥狀確實(shí)有改善。這也從側(cè)面表明干細(xì)胞的治療作用可能不是直接通過分化成為子宮內(nèi)膜細(xì)胞，而更多的是通過分泌的細(xì)胞因子起作用。

(二)子宮內(nèi)膜間充質(zhì)細(xì)胞(eMSCs)

eMSCs作為一種多分化和高增殖潛能的干細(xì)胞，能夠像其他干細(xì)胞一樣被用于多種學(xué)科的再生醫(yī)學(xué)[13]。已經(jīng)有證據(jù)表明eMSCs能在體外轉(zhuǎn)化為內(nèi)膜上皮和基質(zhì)細(xì)胞。同時(shí)，相對(duì)于健康對(duì)照組，宮腔粘連患者的內(nèi)膜組織中擁有較少的干細(xì)胞[14]。目前，能夠通過多種方法從月經(jīng)血中獲得此類干細(xì)胞，故又稱經(jīng)血干細(xì)胞[13，15-16]。其獲取的條件具有重復(fù)性和非侵襲性等優(yōu)點(diǎn)，是良好的間充質(zhì)干細(xì)胞來源。

1.臨床案例：除了BMSCs案例以外，臨床上也有利用eMSCs來治療7名重度宮腔粘連患者的報(bào)道。通過宮腔內(nèi)移植1×106個(gè)表現(xiàn)為CD44、CD73、CD90 和 CD105陽(yáng)性的細(xì)胞，最終結(jié)果顯示其中的5名患者的子宮內(nèi)膜增厚達(dá)7～8 mm，1名自然懷孕，2名經(jīng)胚胎移植后成功懷孕[13]。

2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：為探究eMSCs在子宮內(nèi)膜損傷疾病中的的治療機(jī)制，Zhang等[17]利用電凝的方式建立子宮內(nèi)膜損傷的小鼠模型，并通過靜脈注射的方式進(jìn)行eMSCs移植。研究結(jié)果顯示接受移植的小鼠內(nèi)膜組織厚度及微血管密度相對(duì)于對(duì)照組均有增加，并且其妊娠結(jié)局也有改善。此外還發(fā)現(xiàn)源自干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基能夠通過激活A(yù)KT和/或ERK通路減少H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移能力并能促進(jìn)新生血管形成。該團(tuán)隊(duì)的另一項(xiàng)研究則在利用95%酒精沖洗宮腔的方式建立SD大鼠子宮內(nèi)膜纖維化模型，他們發(fā)現(xiàn)由eMSCs分泌的粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)能夠通過抑制鋅指蛋白GLI2(Gli2)表達(dá)來減少內(nèi)膜的纖維化[18]。而在此之前，竺海燕[19]已經(jīng)通過細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)血干細(xì)胞條件培養(yǎng)基能顯著促進(jìn)eMSCs的增殖，并通過激活Hippo/TAZ通路、抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)的方式減輕纖維化程度。

(三)脂肪組織來源間充質(zhì)細(xì)胞(aASCs)

盡管BMSCs是目前應(yīng)用最為廣泛的干細(xì)胞來源，但其創(chuàng)傷性的收集細(xì)胞過程反而加重了病人的痛苦，這點(diǎn)是不可避免的限制。而MSCs的獲取具有重復(fù)性和非侵襲性等優(yōu)點(diǎn)，是良好的BMSCs的替代品。脂肪干細(xì)胞有多種分化能力，已經(jīng)應(yīng)用很多領(lǐng)域，其易獲取性、倫理爭(zhēng)論小和較小的創(chuàng)傷性使之成為一個(gè)理想的干細(xì)胞來源。從脂肪提取物中分離而來的干細(xì)胞在體外能誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞以及肌細(xì)胞等[20]。ASCs的分化潛能和其他間充質(zhì)干細(xì)胞類似，且他們的分離的產(chǎn)量和培養(yǎng)時(shí)的增殖速率都要高于BMDCs[21]。針對(duì)ASCs的細(xì)胞表型分析發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞表達(dá)CD34、73、CD90以及CD105，不表達(dá)CD31、CD45[22]。其能分泌一些細(xì)胞因子，具有促血管生成、抑制免疫以及抗氧化的作用[23]。但ASCs是否能夠有效修復(fù)損傷的子宮內(nèi)膜、使之恢復(fù)正常生理狀態(tài)仍具有爭(zhēng)議。目前為止還未見有關(guān)脂肪來源干細(xì)胞治療宮腔粘連的案例報(bào)道。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：Kilic等[24]將2×106個(gè)CD90、CD44和CD49表達(dá)陽(yáng)性，而CD11b/c、CD45表達(dá)陰性的ASCs注射到三氯乙酸誘導(dǎo)的宮腔粘連大鼠的一側(cè)子宮角，之后連續(xù)3次腹腔內(nèi)注射，每次間隔5 d。結(jié)果顯示有4%～6%的經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞在子宮組織被發(fā)現(xiàn)，同時(shí)還觀察到新生血管增多、纖維化面積減少。但在纖維化降低方面，單純干細(xì)胞治療組較對(duì)照組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，反而單純雌激素和干細(xì)胞結(jié)合雌激素治療效果更加明顯。國(guó)內(nèi)的孔德勝[8]利用物理?yè)p傷和細(xì)菌脂多糖感染的雙重?fù)p傷法建立大鼠宮腔粘連模型，通過子宮肌壁間注射和復(fù)合小腸黏膜下基質(zhì)支架(SIS)的方式移植2×106大鼠ASCs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單純ASCs注射移植無明顯效果，只在后期發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜細(xì)胞上皮化優(yōu)于模型組，并且原位注射的宮角后期只可見少量經(jīng)綠色熒光標(biāo)記的ASCs存活，至21 d時(shí)，只有極少量細(xì)胞存在。而SIS復(fù)合或不復(fù)合ASCs的方式不僅可以改善子宮內(nèi)膜的病理狀態(tài)指標(biāo)，還可以提高子宮內(nèi)膜容受性，胚胎數(shù)目增加。此外，SIS復(fù)合ASCs治療效果較單純SIS治療組效果更佳[8]。這表明該種支架能有利于細(xì)胞的生存和生長(zhǎng)，以此增加ASCs的治療效果。在這之前，Hunter等[25]就探索過脂肪來源間質(zhì)血管部分細(xì)胞(SVF)能否改善子宮內(nèi)膜形態(tài)和容受性。SVF主要成分是脂肪干細(xì)胞。他們利用無水酒精成功誘導(dǎo)形成了SD大鼠薄型子宮模型，并在此基礎(chǔ)上宮腔內(nèi)注射0.5 ml含有1×106細(xì)胞的懸液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)子宮容受性的形態(tài)學(xué)和功能學(xué)上并未顯示有意義的改善，但降低了舒張微血管的緊張度，增加了組織流量。為檢測(cè)受體組織中的GFP陽(yáng)性的SVF細(xì)胞分布情況，該團(tuán)隊(duì)還進(jìn)行了3D共焦成像，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞植入不良，沒有陽(yáng)性細(xì)胞存在。

雖然上述造模方式、給藥方式有些許差異，對(duì)實(shí)驗(yàn)造成了一定的影響。但從總體來看，單純?cè)蛔⑸涓杉?xì)胞對(duì)于修復(fù)子宮內(nèi)膜效果不佳，其可能原因與干細(xì)胞的在宮腔內(nèi)的保留與植入能力有關(guān)。因此如何增強(qiáng)脂肪來源干細(xì)胞的活性及生存能力成了至關(guān)重要的問題。受上述實(shí)驗(yàn)的啟發(fā)，筆者認(rèn)為可以從增加給藥次數(shù)、延長(zhǎng)給藥時(shí)間、用靜脈注射替代原位注射及聯(lián)合一些其他藥物共同治療等方面入手。近年，南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院的魯峰教授團(tuán)隊(duì)發(fā)明了一項(xiàng)新專利SVF-gel，即脂肪干細(xì)胞膠。其是通過物理方法有效去除脂肪組織中的油滴后，得到的富含脂肪干細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的產(chǎn)物，后者主要成分是膠原蛋白，彈性蛋白和粘多糖。相對(duì)于普通脂肪組織，其保留了大部分ECM，為脂肪干細(xì)胞提供了良好的生存環(huán)境，增加其生存率。已有實(shí)驗(yàn)證明其在皮膚傷口愈合方面具有促進(jìn)作用[26]。筆者認(rèn)為其可能在未來能夠應(yīng)用于宮腔粘連等纖維化相關(guān)疾病的治療。

同時(shí)，在脂肪干細(xì)胞使用的安全性方面，有團(tuán)隊(duì)嘗試在移植前對(duì)其進(jìn)行γ射線輻射處理，減少其增殖能力，但仍保留了促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生的能力[27]，這一試驗(yàn)也從一方面說明干細(xì)胞修復(fù)機(jī)制不完全依賴于自身的增殖分化，其還能夠分泌一些因子來產(chǎn)生作用。

(四)其他來源

除了上述幾種主要來源的干細(xì)胞以外，還有報(bào)道利用羊膜間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞[28]、人早孕蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞[29]、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞[30]等探究干細(xì)胞對(duì)于宮腔粘連和子宮內(nèi)膜損傷的治療效果和機(jī)制。

四、小結(jié)

重度宮腔粘連的治療與預(yù)防復(fù)發(fā)目前仍是難點(diǎn)，而基于干細(xì)胞治療的再生醫(yī)學(xué)為其創(chuàng)造了條件。來源廣泛的干細(xì)胞為人們提供了多樣化的選擇，但同時(shí)，大樣本數(shù)據(jù)的缺乏使得無法形成標(biāo)準(zhǔn)化的干細(xì)胞治療方案，上述文獻(xiàn)中涉及的造模方式、用藥途徑和用藥劑量都存在一定差異，由此可能產(chǎn)生了不同、甚至相反的結(jié)局，以至于無法有效的進(jìn)行分析比對(duì)，未來仍需進(jìn)行大樣本的實(shí)驗(yàn)。此外，單純移植干細(xì)胞的效果并不理想，可能原因在于移植的干細(xì)胞受宮腔內(nèi)環(huán)境影響無法產(chǎn)生定植、分泌的效果，因此如何在一段時(shí)間內(nèi)維持和增強(qiáng)細(xì)胞的生存和分泌作用需要進(jìn)行更深入的研究。更為理想的治療方案是分離出有效的細(xì)胞因子代替干細(xì)胞對(duì)宮腔粘連及子宮內(nèi)膜損傷進(jìn)行治療，但更全面的機(jī)制仍需要進(jìn)一步的探索。隨著研究的深入進(jìn)行，基于間充質(zhì)干細(xì)胞的子宮內(nèi)膜修復(fù)和治療將會(huì)更加準(zhǔn)確、有效。