葉勇剛，廖黨金，張明國(guó)，康潤(rùn)民，肖 璐，謝 晶，曹 冶，張 濤

（1.四川省畜牧科學(xué)研究院，成都 610066；2.動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 成都 610066；3.涼山科華奶牛繁育有限公司，西昌615099；4.涼山州畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，西昌 615042）

肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella peneumoniae）屬腸桿菌科腸道桿菌屬克雷伯氏菌種，是一種人獸共患、革蘭氏陰性條件致病菌。該菌在自然界廣泛分布，可存在于人、畜禽的呼吸道和消化道，一般情況下不致病，但當(dāng)動(dòng)物機(jī)體免疫力下降時(shí)，可引發(fā)支氣管炎、肺炎、泌尿系統(tǒng)和創(chuàng)傷感染、敗血癥、腦膜炎、腹膜炎等[1-4]。近年來(lái)肺炎克雷伯氏菌引發(fā)的家畜疾病屢見(jiàn)報(bào)到，但感染奶牛的報(bào)道相對(duì)較少，尤其未見(jiàn)引起奶牛流產(chǎn)[5-8]。

2017年4月，四川攀西地區(qū)一奶牛（荷斯坦）養(yǎng)殖小區(qū)發(fā)生1例懷孕7個(gè)月奶牛流產(chǎn)，母牛出現(xiàn)子宮內(nèi)膜炎及疑似癱瘓癥狀，采用補(bǔ)鈣和一般抗生素治療后，效果不良。本研究從無(wú)菌采集的胎兒腹水和心血中分離到1株革蘭氏陰性短桿菌，通過(guò)微生物分離純化、生化鑒定、16S rRNA 擴(kuò)增測(cè)序、小鼠致病性試驗(yàn)鑒定該菌株為致病性肺炎克雷伯氏菌，并根據(jù)藥敏試驗(yàn)的結(jié)果，給予母牛治療，最終母牛得以治愈。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基、抗生素藥敏紙片和微量生化反應(yīng)管均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；Mueller-hinton agar和Mueller-hinton BROTH購(gòu)自上海葉舟生物科技有限公司；2×TaqPCR Mastermix和凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；D2000 Plus DNA ladder購(gòu)自中科瑞泰生物科技有限公司。

1.1.2 病料和試驗(yàn)動(dòng)物 流產(chǎn)胎兒組織樣本來(lái)自四川攀西地區(qū)某奶牛養(yǎng)殖小區(qū)；40 d昆明鼠購(gòu)置四川成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.3 引物 16S rRNA通用引物 27F: 5'-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3'；1492R: 5'-GGTTACCT TGTTACGACTT-3'；16S～23S rRNA 通用引物（Jensen等[9]設(shè)計(jì)）F: 5'-GAAGTCGTAGTAA CAAGG-3'；R: 5'-CAAGGCATCCACCGT-3'。引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離純化 用接種環(huán)無(wú)菌采集流產(chǎn)胎兒心血和腹水接種于肉湯培養(yǎng)基中，帶回實(shí)驗(yàn)室37℃培養(yǎng)，過(guò)夜后于超凈臺(tái)無(wú)菌涂于血瓊脂培平板上分離單菌落，并對(duì)分離株純培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，觀察細(xì)菌個(gè)體形態(tài)，然后接種于麥康凱培養(yǎng)基觀察其培養(yǎng)特征。

1.2.2 生化試驗(yàn) 將分離純化的細(xì)菌接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂中，培養(yǎng) 24 h并按照微量生化管說(shuō)明書進(jìn)行生化試驗(yàn)。

1.2.3 16S rRNA和16S～23S rRNA 核苷酸序列鑒定挑取單菌落溶于10 μL ddH2O混成菌液作為DNA模板。反應(yīng)體系（20 μL）：DNA模板(菌液)1 μL，PCR Mstermix 10 μL，dd H2O 7 μL，上下游引物各1 μL（50 ng/μL）。PCR反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性2 min，94℃變性30 S， 55℃退火30 S，72℃ 延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳后回收，純化后送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在 NCBI上進(jìn)行BLAST 比對(duì)鑒定。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 采用紙片瓊脂擴(kuò)散方法，對(duì)常見(jiàn)的28種抗生素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果參照 national committee clinicallaboratory standards（NCCLS）藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)按敏感、中度敏感和耐藥進(jìn)行判定。

1.2.5 致病性試驗(yàn) 挑取分離純化的單菌落于Muellerhinton BROTH培養(yǎng)基中35℃搖菌培養(yǎng)過(guò)夜，部分用比濁管按1.2×109cfu/mL稀釋。將小白鼠分為4個(gè)組，每組5只，第1組于腹腔接種培養(yǎng)過(guò)夜原菌液0.2 mL；第2組于腹腔接種濃度為1.2×109cfu/mL菌液0.2 mL；第3組為對(duì)照組，于腹腔接種MH培養(yǎng)基0.2 mL；第4組為對(duì)照組，不接種任何物質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)在麥康凱培養(yǎng)基和血瓊脂平板培養(yǎng)基上均長(zhǎng)出1～2 mm的黏液狀菌落，經(jīng)革蘭氏染色后，鏡檢見(jiàn)革蘭氏陰性短桿菌，兩端鈍圓，見(jiàn)圖1。

2.2 生化特性該菌能分解葡萄糖和乳糖，分解葡萄糖能產(chǎn)酸產(chǎn)氣，能還原硝酸鹽，分解尿素，V-P試驗(yàn)呈陽(yáng)性。該分離菌的生化特征基本與報(bào)道的肺炎克雷伯氏菌一致[10]，具體見(jiàn)表1。

2.3 16S rRNA和16S～23S rRNA基因鑒定16S rRNA基因擴(kuò)增結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增片段位于1000～2000 bp（見(jiàn)圖2A）。BLAST結(jié)果顯示，分離菌株的16S rRNA基因序列與肺炎克雷伯氏菌 16S rRNA基因序列的同源性為 99%，16S～23S rRNA基因擴(kuò)增結(jié)果顯示，該P(yáng)CR擴(kuò)增出3個(gè)片段（見(jiàn)圖2B），測(cè)序結(jié)果表明該分離株的16S～23S rRNA序列與肺炎克雷伯氏菌的16S～23S rRNA同源性最高。以上結(jié)果表明，該分離細(xì)菌為肺炎克雷伯氏菌。

圖1 肺炎克雷伯氏菌革蘭氏染色Fig.1 Gran staining of Klebsiella pneumoniae

表1 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果Table 1 The results of biochemical test of the bacteria

圖2 16S rRNA (A)和 16S～23S rRNA(B)基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 The PCR ampli fication of 16S rRNA (A) and 16S～23S rRNA gene(B)

2.4 藥敏試驗(yàn)在選用的常見(jiàn)28種抗生素中，該分離菌株對(duì)氨芐西林、頭孢曲松、頭孢唑林、多粘菌素等16種抗生素敏感；對(duì)多西環(huán)素、四環(huán)素、新霉素等7種抗生素中度敏感；對(duì)青霉素、苯唑西林、紅霉素、米諾環(huán)素和氯唑西林耐藥，具體見(jiàn)表2。

2.5 動(dòng)物試驗(yàn)接種0.2 mL原菌液組的小鼠于24 h內(nèi)全部死亡，接種0.2 mL 1.2×109cfu/mL菌液組小鼠于36 h內(nèi)全部死亡；而對(duì)照未見(jiàn)任何臨床癥狀。解剖小鼠，可見(jiàn)其肺臟、胸腔有明顯出血，腹腔有大量積液；取腹腔積液或胸腔積液進(jìn)行染色鏡檢，均可見(jiàn)大量革蘭氏陰性短桿菌，與犢牛分離病原菌形態(tài)一致。

3 討論

PCR和DNA堿基測(cè)序技術(shù)用于鑒定細(xì)菌種類具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已經(jīng)廣泛用于對(duì)未知菌種進(jìn)行檢測(cè)。其中16S rRNA和16S～23S rRNA 編碼的基因序列具有高度保守和變異的特性，是用于鑒定細(xì)菌的理想靶序列[11,12]。16S rRNA適合于細(xì)菌屬內(nèi)種間的鑒定，在分類學(xué)中被譽(yù)為“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于進(jìn)化慢，序列相對(duì)保守，對(duì)相近種或同一種不同型之間進(jìn)行鑒別存在一定缺陷，如大腸埃希菌與宋內(nèi)志賀菌、炭疽桿菌與蠟樣芽胞桿菌的16S rRNA序列相同，因此無(wú)法用此基因片段進(jìn)行鑒別[13]。而16S～23S rRNA間隔區(qū)序列（intergenic spacer region，ISR）除保守外，其進(jìn)化速度高于16S rRNA的10倍，能對(duì)相近菌種和同種內(nèi)的不同菌株進(jìn)行鑒別，成為細(xì)菌分類和鑒定的熱點(diǎn)[14]。本試驗(yàn)采用16S rRNA通用引物，成功擴(kuò)增了16S rRNA基因片段，通過(guò)測(cè)序確定了該分離菌株為肺炎克雷伯氏菌。此外，本研究還借鑒了Jesen等[9]設(shè)計(jì)的經(jīng)典引物對(duì)本株肺炎克雷伯氏菌進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果顯示在250～500 bp間出現(xiàn)3條帶的特異性圖譜，測(cè)序結(jié)果同樣證明了該分離菌株為肺炎克雷伯氏菌。

據(jù)報(bào)道，肺炎克雷伯氏菌可產(chǎn)生各種使抗生素失活的酶，如產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶、頭孢菌素酶和碳青霉烯酶；此外，肺炎克雷伯氏菌還可通過(guò)缺失菌體外模蛋白、改變抗生素作用靶位，以及產(chǎn)生生物膜等機(jī)制產(chǎn)生耐藥[15]。畜禽生產(chǎn)過(guò)程中，抗生素作為促生長(zhǎng)的飼料添加藥物和臨床不合理使用抗生素，使畜禽肺炎克雷伯氏菌產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of drug sensitive test

肺炎克雷伯氏菌引發(fā)的疾病越來(lái)越常見(jiàn)，現(xiàn)均能從人、牛、羊、豬、皮毛動(dòng)物等中分離到致病性肺炎克雷伯氏菌。肺炎克雷伯氏菌感染奶牛主要造成奶牛乳房炎、肺炎、子宮內(nèi)膜炎，也有報(bào)道在流產(chǎn)奶牛胎兒中分離到肺炎克雷伯氏菌，但其不是造成奶牛流產(chǎn)的主要病因[16,17]。本試驗(yàn)從流產(chǎn)奶牛胎兒心血和腹腔液中分離到1株細(xì)菌，采用16S rRNA基因擴(kuò)增測(cè)序、生化鑒定等方法確定該分離菌株為肺炎克雷伯氏菌，小白鼠感染試驗(yàn)證明其具有很強(qiáng)的致病力；加之沒(méi)有分離到其他的病原菌，由此判斷，可能是孕牛免疫力低下，肺炎克雷伯氏菌乘機(jī)在孕牛體內(nèi)大量繁殖而引起奶牛發(fā)病和流產(chǎn)，病原菌經(jīng)垂直傳播給胎兒。另外試驗(yàn)還通過(guò)藥敏試驗(yàn)，篩選出敏感性藥物并對(duì)臨床生產(chǎn)進(jìn)行指導(dǎo)用藥，取得了較好的治療效果，進(jìn)一步證明了該奶牛的流產(chǎn)與肺炎克雷伯氏菌相關(guān)。肺炎克雷伯氏菌作為一種人獸共患病原菌，奶牛場(chǎng)應(yīng)加大對(duì)該類疫病的預(yù)防，除科學(xué)使用抗生素外，還需加強(qiáng)衛(wèi)生消毒，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，用藥前多做相關(guān)藥敏試驗(yàn)，實(shí)施針對(duì)性用藥，提高防治效果。