曹 興，張秀省，高祥斌，義鳴放，呂福堂*

(1.聊城大學農(nóng)學院，山東聊城252059；2.中國農(nóng)業(yè)大學園藝學院/花卉發(fā)育與品質(zhì)調(diào)控北京市重點實驗室，北京100193)

百合(Liliumspp.)為百合科百合屬球根花卉，具有重要的觀賞、食藥用價值。百合多數(shù)喜微酸性土壤，土壤高鹽分會抑制百合的生長發(fā)育，降低切花的產(chǎn)量和質(zhì)量，并造成種球退化。因此，解析百合的鹽脅迫響應機制，鑒定調(diào)控耐鹽性的關鍵基因，對于采用基因工程技術來提高百合的耐鹽性具有重要的理論和實踐意義。

作為植物體中普遍存在的第二信使，Ca2+參與調(diào)控植物的生長發(fā)育和多種逆境脅迫響應。植物感受外界刺激后，細胞中的Ca2+濃度在時空上出現(xiàn)特異性的變化，這種變化會被相應的Ca2+感受器所感知，進一步將信號傳遞給下游的靶蛋白，從而引發(fā)細胞內(nèi)一系列的生理生化反應來響應逆境脅迫。目前，植物中發(fā)現(xiàn)的Ca2+受體蛋白主要分為三類：鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM) 、類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白(calcineurin B-like proteins，CBL)和鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase，CDPK)[1]。其中，CBL僅存在于高等植物中，與其下游靶蛋白CIPK(CBL-interacting protein kinase) 組成CBL-CIPK 信號轉(zhuǎn)導途徑，在植物響應逆境脅迫過程中發(fā)揮重要作用。到目前為止擬南芥中鑒定了10個CBL基因和25個CIPK基因，CBL1、CBL4、CBL10都能與CIPK24互作提高擬南芥的耐鹽性[2-4]。

本研究以麝香百合雜種系(L.longiflorumHybrids)品種‘白天堂’(‘White Heaven’)為試驗材料，從中克隆了CBL基因，分析了百合CBL蛋白特性及CBL基因在鹽脅迫下的表達模式，以期為進一步研究CBL基因在百合耐鹽性調(diào)節(jié)方面的功能及作用機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為麝香百合雜種系品種‘白天堂’(L.longiflorumcv. ‘White Heaven’)組培苗，培養(yǎng)條件為22 ℃，光照時間為16 h/d。亞細胞定位使用的材料為紫皮洋蔥(Alliumcepa)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，試驗所用引物見表1。DNA測序由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 百合CBL基因的克隆 取百合葉片用液氮研磨，根據(jù)天根公司多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書提取RNA。cDNA的合成根據(jù)Takara公司的Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H)說明書進行，反轉(zhuǎn)錄接頭引物為AP。

(1)LlCBL1基因的克隆?；?′端序列的克?。喊凑誘aKaRa公司5′-Full RACE kit說明書進行。根據(jù)實驗室之前獲得的百合CBL1基因片段設計兩條下游特異引物SPR1和SPR2，與試劑盒自帶的兩條5′端接頭引物進行巢式PCR擴增。第一輪引物為5′RACE Outer primer和SPR1，反應程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。取第一輪產(chǎn)物1 μL進行第二輪反應，引物為5′ RACE Inner primer和SPR2，反應程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，33個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)序列的校正：將已經(jīng)獲得的目的基因片段用DNAMAN 5軟件拼接，并在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上預測其ORF，根據(jù)ORF兩端序列設計上游特異引物SPF1和下游特異引物SPR3，用保真性較高的PrimeSTAR?HS DNA Polymerase擴增目的基因的ORF序列。反應程序為：98 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 50 s，33個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

PCR產(chǎn)物用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測后切膠回收，連接到pUM-T載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，Amp抗性培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后，挑取單克隆進行菌落PCR檢測，將含有目的基因片段的陽性克隆送公司測序。

(2)LlCBL3基因的克隆。根據(jù)NCBI上已報道的擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtCBL3的mRNA序列，利用BLAST程序搜索與其高度相似的百合表達序列標簽(Expressed Sequence Tag,EST)。然后將該序列在NCBI上進行同源比對，用ORF Finder程序預測其ORF。在起始密碼子上游設計特異引物SPF2(上游)，在終止密碼子下游設計特異引物SPR4(下游)，使用PrimeSTAR?HS DNA聚合酶進行ORF全長校正，PCR反應條件：98 ℃ 5 min，98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，33個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.2 LlCBL1與LlCBL3的生物信息學分析 用Primer Premier 5軟件將目的基因的ORF序列翻譯成氨基酸序列；用EXPASY (https://www.expasy.org/tools/)中的ProtParam、SMART、SignalP、TMHMM、PSORT、NetPhos，PSMP(http://plantsp.genomics.purdue.edu/myrist.html)等在線工具對蛋白質(zhì)進行生物信息學分析；用DNAMAN 5對氨基酸序列進行多重比對分析；用MEGA 5軟件構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 LlCBL1與LlCBL3的亞細胞定位 利用DNAMAN 5分析LlCBL1 ORF序列的酶切位點，結合pSAT6-GFP載體，選用HindⅢ和PstI作為融合表達載體構建的酶切位點，并設計上游特異引物SPF3和下游特異引物SPR5進行PCR擴增。雙酶切pSAT6-GFP空載質(zhì)粒和PCR擴增產(chǎn)物，純化酶切產(chǎn)物并用T4連接酶連接，獲得pSAT6-LlCBL1-GFP重組表達載體，雙酶切和測序驗證連接是否成功。用同樣的方法構建pSAT6-LlCBL3-GFP重組表達載體，選用的限制性內(nèi)切酶為HindⅢ和PstI，設計的特異引物為SPF4(上游)和SPR6(下游)。用基因槍轟擊法[5]將構建好的重組表達載體轟擊到在MS培養(yǎng)基上預培養(yǎng)24 h的洋蔥表皮細胞中，暗培養(yǎng)24 h后用激光共聚焦顯微鏡(Nikon Eclipse TE2000-E)觀察和拍照，并用EZ-C1軟件對照片進行分析和處理。

1.2.4LlCBL1與LlCBL3的表達分析 選擇生長良好、長勢一致的‘白天堂’組培苗作為基因表達分析的材料。

LlCBL1、LlCBL3在不同組織中的表達：分別取常溫(22 ℃)培養(yǎng)的百合組培苗的根、鱗莖和葉片。

LlCBL1、LlCBL3在鹽脅迫下的表達：常溫(22 ℃)下，用20 mL 100 mmol/L NaCl溶液浸沒百合組培苗根系，分別在處理0、1、3、6和12 h取葉片。

所取組織用液氮速凍并保存于-80 ℃的超低溫冰箱中備用提取RNA。采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)的方法檢測基因的表達，LlCBL1的擴增引物為qF1和qR1，LlCBL3的擴增引物為qF2和qR2，內(nèi)參基因18S rRNA的擴增引物為18SqF和18SqR。實驗參照Takara公司的SYBR Premix Ex TaqTMkit熒光定量試劑盒說明書進行，儀器為Applied Biosystems Prism 7300 PCR儀。采用兩步法進行PCR擴增，反應程序為：95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，1個循環(huán)。每個樣品重復3次。采用2-ΔΔCT方法[6]分析基因的相對表達量，用Excel軟件分析數(shù)據(jù)。

表1 PCR引物

表中下劃線表示酶切位點

Underline represents enzyme cleavage site

2 結果與分析

2.1 百合LlCBL1與LlCBL3基因的克隆

將獲得的目的基因在NCBI上進行BLAST比對，分別定名為LlCBL1(GenBank登錄號JQ911694)和LlCBL3(GenBank登錄號JQ713001)。其中，LlCBL1基因ORF區(qū)序列長為642 bp，編碼213個氨基酸(圖1，a)；LlCBL3基因ORF區(qū)序列長為672 bp，編碼223個氨基酸(圖1，b)。

a.LlCBL1開放閱讀框及編碼的氨基酸序列;b.LlCBL3開放閱讀框及編碼的氨基酸序列a.The open reading frame of LlCBL1 and the predicted amino acid sequences;b.The open reading frame of LlCBL3 and the predicted amino acid sequences圖1 百合CBL基因開放閱讀框及編碼的氨基酸序列Fig.1 The open reading frame of lily CBL genes and the predicted amino acid sequences

2.2 百合LlCBL1與LlCBL3的生物信息學分析

ProtParam在線工具預測百合LlCBL1蛋白包含213個氨基酸殘基，分子式為C1102H1709N279O334S6，分子量為24.41 ku，屬于穩(wěn)定蛋白、親水性蛋白和酸性蛋白。LlCBL3蛋白包含223個氨基酸殘基，分子式為C1162H1806N294O349S6，分子量為25.67 ku，屬于不穩(wěn)定蛋白、親水性蛋白和酸性蛋白。蛋白質(zhì)信號肽預測程序SignalP預測LlCBL1和LlCBL3均不含信號肽，蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域預測軟件TMHMM未發(fā)現(xiàn)LlCBL1和LlCBL3有明顯的跨膜區(qū)域，蛋白質(zhì)亞細胞定位工具PSORT預測LlCBL1主要定位于細胞質(zhì)、細胞核內(nèi)，LlCBL3主要定位于細胞質(zhì)、線粒體內(nèi)。

蛋白質(zhì)磷酸化位點預測工具NetPhos預測LlCBL1含有13個絲氨酸(Ser)、5個蘇氨酸(Thr)及1個酪氨酸(Tyr)潛在磷酸化位點，LlCBL3含有12個絲氨酸(Ser)、7個蘇氨酸(Thr)潛在磷酸化位點，這些潛在的磷酸化位點可能是CBL活性和功能調(diào)控所必需的。蛋白質(zhì)結構域預測工具SMART預測LlCBL1和LlCBL3均含有4個EF手型基序(EF-hand motif)(圖2)。EF手型結構域是CBL的特征結構，該結構能夠結合Ca2+，使得CBL能夠解碼環(huán)境Ca2+信號。與百合鈣調(diào)蛋白LlCaM3[7]的典型EF手(canonical EF-hand)相比，LlCBL1的EF1和EF2的關鍵氨基酸位點發(fā)生了取代，導致Ca2+結合活性降低甚至不能結合Ca2+，這些稱為非典型EF手(noncanonical EF-hand)，因此LlCBL1含有2個典型EF手型基序和2個非典型EF手型基序。與LlCaM1相比，LlCBL3的4個EF手均為非典型EF手型基序。LlCBL1和LlCBL3的C端含有1個保守的PFPF基序(PFPF motif)，在該結構域中被苯丙氨酸-脯氨酸殘基(Phe-Pro)和Phe殘基包圍的Ser殘基是CIPK磷酸化作用的靶點(圖2)。與LlCBL3相比，蛋白質(zhì)豆蔻?；A測工具PSMP在LlCBL1的N端發(fā)現(xiàn)了1個豆蔻酰化基序(N-Myristoylation motif)(圖2)，該基序可能在LlCBL1的蛋白互作和膜錨定過程中發(fā)揮重要作用。

Ll:百合Lilium longiflorum;LlCBL1:AFU36090;LlCBL3:AFI41211;LlCaM3:AFA89863圖2 百合CBL與CaM氨基酸序列比對Fig.2 Alignment of the amino acid sequences of LlCBL1,LlCBL3 and LlCaM3

圖中各節(jié)點處數(shù)字代表可信度。Eg:油棕;Pd:海棗;Ao:石刁柏;Ll:百合;Os:水稻;Ta:小麥;Vv:葡萄;At:擬南芥The numbers at the node of the figure is credibility.Eg:Elaeis guineensis;Pd:Phoenix dactylifera;Ao:Asparagus officinalis;Ll:Lilium longiflorum;Os:Oryza sativa;Ta:Triticum aestivum;Vv:Vitis vinifera;At:Arabidopsis thaliana圖3 百合LlCBL1、LlCBL3與其他植物CBL家族系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic relationship of LlCBL1，LlCBL3 with other plant CBLs

將百合LlCBL1及與其同源性較高的其他植物的CBL1、LlCBL3及與其同源性較高的其他植物的CBL3、擬南芥AtCBL1-AtCBL10的氨基酸序列，用MEGA 5構建系統(tǒng)進化樹，結果顯示CBL家族可分為兩個亞族：第Ⅰ亞族包括CBL1、CBL4、CBL5、CBL8、CBL9；CBL2、CBL3、CBL6、CBL7、CBL10歸屬第Ⅱ亞族。百合LlCBL1與同為單子葉植物的油棕(Elaeisguineensis)EgCBL1、海棗(Phoenixdactylifera)PdCBL1的親緣關系最近(圖3)，相似度達92%。百合LlCBL3與同為百合科的石刁柏(Asparagusofficinalis)AoCBL3的親緣關系最近(圖3)，相似度達92%。特征結構域和系統(tǒng)進化分析的結果進一步說明本研究分離得到的LlCBL1和LlCBL3基因分別屬于植物CBL1和CBL3的同源基因。

2.3 百合LlCBL1與LlCBL3亞細胞定位

利用基因槍將構建好的瞬時表達載體pSAT6-LlCBL1-GFP和pSAT6-LlCBL3-GFP轟擊到經(jīng)過24 h預培養(yǎng)的洋蔥表皮細胞中，暗培養(yǎng)24 h后放置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。結果表明，空載對照pSAT6-GFP的熒光信號分布在整個細胞中，包括細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核，在細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核中也檢測到了pSAT6-LlCBL3-GFP的熒光信號，而pSAT6-LlCBL1-GFP的熒光信號僅在細胞膜中檢測到(圖4)。表明LlCBL3在細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核中表達，LlCBL1在細胞膜中表達。

2.4 百合LlCBL1與LlCBL3的表達分析

利用qPCR檢測了LlCBL1與LlCBL3的時空表達。結果表明，常溫(22 ℃)下，LlCBL1、LlCBL3在百合根、鱗莖和葉中均有表達，LlCBL1在根中的表達量最高，鱗莖中次之，葉中最低；LlCBL3在葉中的表達量最高，根中次之，鱗莖中最低(圖5，a)。在鹽脅迫處理1～12 h內(nèi)，百合葉片中LlCBL1的相對表達量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，但始終高于對照，在處理6 h時達到峰值，約為對照的6.33倍(P<0.05)；百合葉片中LlCBL3的相對表達量也呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，但僅在1～3 h內(nèi)的相對表達量顯著高于對照(P<0.05)，鹽脅迫處理3 h的相對表達量是對照的3.10倍(圖5，b)。

圖4 LlCBL1與LlCBL3在洋蔥表皮中的亞細胞定位Fig.4 Subcellular localization of LlCBL1 and LlCBL3 in onion epidermal cells

a.LlCBL1與LlCBL3在根、鱗莖、葉中的表達；b.葉片LlCBL1與LlCBL3在不同NaCl處理時間下的表達,*表示各點與0 h的表達量在P<0.05水平差異顯著a.The expression of LlCBL1 and LlCBL3 in root,bulb and leaf;b.The expression of LlCBL1 and LlCBL3 in leaf treated with 100 mM NaCl at different time,*represent significant correlation at 0.05 level圖5 LlCBL1與LlCBL3時空表達模式Fig.5 Expression pattern of LlCBL1 and LlCBL3 in lily

3 討論

百合屬于鹽敏感性植物，我國北方地區(qū)土壤的鹽漬化阻礙了百合的種植及發(fā)展，因此培育耐鹽品種是百合育種的重要內(nèi)容。目前，有關百合的鹽脅迫研究主要集中在以下幾個方面：(1)百合對鹽脅迫的形態(tài)及生理響應[8-9]。(2)百合種質(zhì)耐鹽性比較[10-11]。(3)利用化學、微生物或雜交育種的方法提高百合的耐鹽性[12-15]。除常規(guī)雜交育種外，百合耐鹽轉(zhuǎn)基因育種也取得了初步進展。鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)JERF3基因的百合小鱗莖的發(fā)芽率顯著高于野生型，死亡率顯著低于野生型，表明轉(zhuǎn)基因百合的耐鹽性能明顯提高[16]。將6-磷酸山梨醇脫氫酶(S6PDH)基因?qū)膑晗惆俸?，鹽脅迫下轉(zhuǎn)化植株的電導率和MDA含量均小于對照，可溶性蛋白含量高于對照，且具有比對照更高的酶活性，說明轉(zhuǎn)化苗的抗鹽性較強[17]。

對百合耐鹽功能基因的研究，除了上述的S6PDH、JERF3外，還包括APX[18]、LLA23[19]等，但對于在植物鹽脅迫響應中起關鍵作用的CBL基因的研究尚未見報道。CBL通過與CIPK互作解碼特異鈣信號所組成的Ca2+-CBL-CIPK信號系統(tǒng)是植物逆境信號傳導的關鍵途徑，在植物的耐鹽性調(diào)控中發(fā)揮重要作用[20]。CBL為多基因家族，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)擬南芥、水稻、玉米和楊樹CBL家族均含有10個成員，本研究從百合中分離鑒定了LlCBL1和LlCBL3基因，還分離鑒定了LlCBL2與LlCBL4(未發(fā)表)，百合的基因組較大，推測百合中還存在其他CBL基因。CBL蛋白主要由N端和C端兩個球狀結構域組成，每個結構域均含有一對EF手型基序，每個EF手型基序由12個氨基酸殘基組成。與CaM的典型EF手型基序的氨基酸序列(DXD(N)XD(N)(S)GXI(V)D(N)(S)XXE)相比，CBL的EF手型結構存在不同程度的變異，如擬南芥CBL家族的10個成員中，AtCBL1和AtCBL9有2個典型EF手型基序，AtCBL6、AtCBL7、AtCBL8和AtCBL10只含有一個典型EF手型基序，而AtCBL2、AtCBL3、AtCBL4和AtCBL5則沒有典型EF手型基序[1]。百合LlCBL1和LlCBL3的EF手型基序的部分關鍵位點也發(fā)生了氨基酸取代，LlCBL1含有2個典型EF手型基序和2個非典型EF手型基序，LlCBL3的4個EF手型基序均為非典型EF手型基序。EF手型基序中氨基酸序列的變化導致CBL具有不同的Ca2+結合活性，可能解碼來自不同環(huán)境脅迫的Ca2+信號。在LlCBL1和LlCBL3的C端含有保守的PFPF基序，其中P、M、L、F、P和F氨基酸殘基完全保守，位于P與F之間的S殘基是CIPK磷酸化作用的靶點，這一磷酸化機制能夠促進CBL與CIPK互作，并參與對下游靶蛋白活性的調(diào)控，是CBL-CIPK信號途徑的重要調(diào)控機制之一[21]。根據(jù)N端的結構，CBL可以分為兩個亞族，第Ⅰ亞族的N端具有高度保守的豆蔻酰化模序MGCXXSK/T，豆蔻?；堑鞍踪|(zhì)翻譯后修飾的一種方式，在蛋白互作和膜定位方面發(fā)揮作用。在MGCXXSK/T模序中，豆蔻?；饔冒l(fā)生在蛋氨酸后的甘氨酸殘基，發(fā)生豆蔻?；饔玫腃BL蛋白具有較低的膜定位活性，但當甘氨酸后面的半胱氨酸殘基發(fā)生棕櫚酰化后，就能將蛋白定位在細胞膜上[22]。在LlCBL1的N端發(fā)現(xiàn)了1個豆蔻?；?，亞細胞定位的結果證實了LlCBL1主要在細胞膜上表達，這與對同屬第Ⅰ亞族AtCBL1和AtCBL9的研究結果類似[20]。第Ⅱ亞族的N端較長，缺少豆蔻?；⒆貦磅；戎|(zhì)修飾位點。LlCBL3歸屬于第Ⅱ亞族，亞細胞定位的結果表明LlCBL3在細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核中均有表達，這與同屬第Ⅱ亞族的AtCBL3在細胞膜和液泡膜上表達的結果不同[20]。同屬第Ⅱ亞族的AtCBL2和AtCBL6定位于液泡膜上，AtCBL10定位在細胞膜和液泡膜上，AtCBL7在細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核中均有表達[20]。這些多樣而特異的亞細胞定位暗示CBL作為鈣感受器能夠快速傳遞局部鈣釋放事件。

在植物進化過程中，CBLs和CIPKs基因數(shù)量的增加很可能與CBL-CIPK信號系統(tǒng)的功能進化相關，這有利于時空特異性Ca2+信號的識別與解碼，暗示CBL和CIPK進化的復雜性與植物的環(huán)境適應性相一致[23]。擬南芥可以通過CBL4-CIPK24-SOS1通路[3]或CBL10-CIPK24-NHX通路[4]來提高植株對鹽脅迫的耐受性。過表達玉米ZmCBL9、煙草NsylCBL10或楊樹PeCBL6提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性[24-26]。AtCBL1通過互作將AtCIPK24帶至細胞膜參與鹽脅迫反應，AtCBL1還可以與AtCIPK23互作調(diào)控AKT1介導的根細胞K+的吸收與運輸，AtCBL1還參與了干旱脅迫和冷脅迫應答等[23]。沙冬青AmCBL1受鹽、干旱和CaCl2誘導表達，在煙草中過表達AmCBL1提高了植株的耐鹽性和耐旱性[27]。杜梨PbCBL1的表達受鹽脅迫誘導上調(diào)，PbCBL1的轉(zhuǎn)入可以提高大腸桿菌對鹽脅迫的耐受能力[28]。鹽脅迫顯著促進了水稻OsCBL1、OsCBL3和楊樹PeCBL1、PeCBL3的表達[29-30]。本研究中，LlCBL1和LlCBL3的表達受鹽脅迫誘導，但二者的表達模式存在差異。LlCBL3在早期(1～3 h)響應鹽脅迫，LlCBL1在1～12 h內(nèi)持續(xù)響應鹽脅迫，且LlCBL1的相對表達量上調(diào)倍數(shù)顯著高于LlCBL3。

多基因家族、多樣而特異的表達模式和亞細胞定位表明了CBL/CIPK信號轉(zhuǎn)導的特異性與功能的多樣性。課題組從百合中分離了兩個CBL家族基因LlCBL1和LlCBL3，研究了LlCBL1和LlCBL3的亞細胞定位和基因表達模式，結果表明LlCBL1可能與百合的鹽脅迫響應密切相關，但是還需要進一步在模式植物和百合上分析基因功能。本研究為探討百合CBL基因在百合耐鹽性調(diào)節(jié)方面的功能及作用機制奠定了理論基礎。