賀 哲，王園秀，張圣潔，蔣軍喜*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江西南昌330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌330045)

獼猴桃泛指獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(Actinidia)植物，其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特，是我國(guó)近年大力發(fā)展的新興水果之一。江西省奉新縣是我國(guó)獼猴桃主產(chǎn)地之一，其優(yōu)越的自然資源和生態(tài)環(huán)境非常適合獼猴桃種植，但同時(shí)獼猴桃果實(shí)熟腐病(簡(jiǎn)稱果腐病)等病害問題也十分突出[1-2]。果腐病是一種由子囊菌門葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)引起的真菌病害，鑒于真菌的細(xì)胞壁主要成分為幾丁質(zhì)，發(fā)揮幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)的作用無(wú)疑是防治植物真菌病害的一條有效途徑[1,3-6]。近年來，筆者篩選到對(duì)果腐病具有顯著抗性的‘金艷’等獼猴桃品種[2]，并通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶基因在接菌的‘金艷’果實(shí)中呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，此結(jié)果表明幾丁質(zhì)酶基因很可能在‘金艷’抗果腐病中發(fā)揮了作用。為此，按前期獲得的轉(zhuǎn)錄本序列設(shè)計(jì)引物，從‘金艷’中克隆幾丁質(zhì)酶基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為深入研究其抗病功能和轉(zhuǎn)基因利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

江西省奉新縣山口獼猴桃園中處于近成熟期的‘金艷’獼猴桃果實(shí)；葡萄座腔菌菌株BDF-6保存于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理研究室，接種前在PDA平板上活化培養(yǎng)。

1.2 接種方法

將培養(yǎng)菌落外圍菌絲體打成直徑5 mm的菌餅，采用刺傷法將菌餅接種到‘金艷’近成熟果實(shí)上，共接種20個(gè)果實(shí)。接種后72 h從病斑病健交界處對(duì)發(fā)病果肉進(jìn)行取樣，樣品快速取下后立即用液氮速凍并速帶回實(shí)驗(yàn)室于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 獼猴桃總RNA的提取

使用RNA提取試劑盒(上海普洛麥格)，按其操作說明提取樣品總RNA。

1.4 幾丁質(zhì)酶基因的RT-PCR擴(kuò)增

以提取的RNA為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega)按其說明對(duì)獼猴桃?guī)锥≠|(zhì)酶基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的引物按照前期獲得的獼猴桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)自行設(shè)計(jì)，上游引物AcC-F：5′-ATGAGGGTTTGGCTACTAGC-3′，下游引物AcC-R：5′-CTATGCAAAAGGCCTCTGGT-3′，由上海生工生物工程有限公司合成，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度預(yù)期795 bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL，上下游引物各2 μL，cDNA模板4 μL，2×TaqPCR Master Mix 25 μL，無(wú)核酸酶水17 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃補(bǔ)平10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 克隆、測(cè)序及序列分析

回收目的片段，使用pEASY-T3 Cloning Kit試劑盒(北京全式金)按其說明進(jìn)行克隆，將含有目的片段的陽(yáng)性克隆送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。使用Lasergene 7.0 軟件進(jìn)行序列拼接，使用NCBI 中BLAST程序?qū)ζ唇雍玫男蛄羞M(jìn)行在線比對(duì)。

1.6 序列編碼產(chǎn)物生物信息學(xué)分析

進(jìn)入表1所列網(wǎng)址對(duì)獼猴桃?guī)锥≠|(zhì)酶基因編碼產(chǎn)物進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃總RNA提取

對(duì)接種果腐病菌72 h后的金艷獼猴桃果實(shí)進(jìn)行RNA提取，電泳結(jié)果(圖1)顯示28S rRNA和18S rRNA條帶清晰，表明提取的總RNA較完整；條帶明亮，表明總RNA濃度較高，符合實(shí)驗(yàn)要求。

表1 本研究中生物信息學(xué)分析網(wǎng)址匯總

2.2 幾丁質(zhì)酶基因的RT-PCR擴(kuò)增

以提取的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板，進(jìn)行獼猴桃?guī)锥≠|(zhì)酶基因完整編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增到一條長(zhǎng)度約為795 bp的片段(圖2)，片段長(zhǎng)度與預(yù)期相符。

M:DL 2 000 marker;1:目的條帶M:DL 2 000 Marker;1:Target product圖1 ‘金艷’獼猴桃果實(shí)總RNA凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Agrose gel electrophoresis of total RNA in ‘Jin Yan’ kiwifruit

M：DL 2 000 Marker；CK：陰性對(duì)照；1：目的片段M:DL 2 000 Marker;CK:Negative control;1:Target product圖2 獼猴桃?guī)锥≠|(zhì)酶基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of RT-PCR product of chitinase gene of kiwifruit

2.3 幾丁質(zhì)酶基因克隆、測(cè)序及序列分析

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收、克隆和序列測(cè)定，獲得其核苷酸序列長(zhǎng)度為795 bp(在GenBank中登錄號(hào)MH580296)，編碼264個(gè)氨基酸，將克隆的此基因命名為AcCHI1。經(jīng)Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)AcCHI1氨基酸序列與GenBank中的山茶(Camelliasinensis)幾丁質(zhì)酶基因(GenBank登錄號(hào)KR078345.1)氨基酸序列同源性最高，為81%。

2.4 獼猴桃?guī)锥≠|(zhì)酶蛋白生物信息學(xué)分析

2.4.1 蛋白結(jié)構(gòu)特征分析 根據(jù)NCBI蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，AcCHI1隸屬于Chitinase_glyco_hydro_19 domain-containing protein(圖3)，即屬于19家族幾丁質(zhì)酶，而按氨基酸序列特征被描述為Chitinase class I，屬于I 類幾丁質(zhì)酶。

圖3 AcCHI1蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.3 Conserved domains forecast for protein of AcCHI1

2.4.2 蛋白理化性質(zhì)分析 AcCHI1的分子式為C1288H1935N351O371S11，總原子數(shù)3 956，分子質(zhì)量28.6 ku，等電點(diǎn) 8.58。在氨基酸組成上，最多的氨基酸為Gly (G)，共32個(gè)，占12.1%，最少的氨基酸為His (H)和Met (M)，各3個(gè)，占1.1%。酸性氨基酸(Asp+Glu) 19個(gè)，堿性氨基酸(Arg + Lys ) 23個(gè)；脂肪族氨基酸指數(shù)為69.58，不穩(wěn)定指數(shù)為29.48，推測(cè)為穩(wěn)定蛋白。

圖4 AcCHI1疏水區(qū)/親水區(qū)預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of the hydrophobic/hydrophilic regions of AcCHI1

2.4.3 蛋白親疏水性預(yù)測(cè) 蛋白質(zhì)的親水/疏水性特征是蛋白質(zhì)折疊的基礎(chǔ)。利用在線分析軟件ProtScale對(duì)AcCHI1進(jìn)行親水/疏水性分析(圖4)，根據(jù)蛋白質(zhì)親水和疏水的得分判定(即得分<-0.5的區(qū)域?yàn)橛H水區(qū)，得分>0.5的區(qū)域?yàn)槭杷畢^(qū)，得分在+0.5～-0.5的為兩性區(qū))，AcCHI1含有13個(gè)疏水區(qū)，21個(gè)親水區(qū)，因此可以認(rèn)為該蛋白在總體上為親水性蛋白。

2.4.4 跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用TMHMM軟件分析預(yù)測(cè)AcCHI1的跨膜結(jié)構(gòu)(圖5)，圖中紅線代表跨膜，紫線代表膜外，藍(lán)線代表膜內(nèi)，根據(jù)最上端紫色粗線條顯示，全部氨基酸位于膜外，因此，AcCHI1不具有跨膜結(jié)構(gòu)，不屬于膜蛋白。

圖5 AcCHI1跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Transmembrane structure analysis of AcCHI1

2.4.5 信號(hào)肽分析 利用軟件SignalP-4.1對(duì)AcCHI1有無(wú)信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖6)，其中C-Score為剪切位點(diǎn)值；S-Score為信號(hào)肽區(qū)域值；Y-Score為剪切位點(diǎn)校準(zhǔn)值。由圖6可知該蛋白的S值區(qū)間為1～19個(gè)氨基酸之間，C值最大值在第20個(gè)氨基酸，Y值最大值在第20個(gè)氨基酸。因此推斷AcCHI1含有信號(hào)肽，信號(hào)肽區(qū)域?yàn)?～19個(gè)氨基酸，信號(hào)肽剪切位點(diǎn)位于第20個(gè)氨基酸。

2.4.6 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 圖7為利用GOR4預(yù)測(cè)的AcCHI1的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中組成α螺旋(Alpha helix)的氨基酸共48個(gè)，占18.18%，包含在無(wú)規(guī)則卷曲(random coil)中的氨基酸共149個(gè)，占56.44%，組成延伸鏈(extended strand)的氨基酸共67個(gè)，占25.38%。

圖6 AcCHI1信號(hào)肽的預(yù)測(cè)和分析Fig 6. Prediction and analysis of signal peptide of AcCHI1

藍(lán)色線：α螺旋；紅色線：延伸鏈；紫色線：無(wú)規(guī)則卷曲Blue line:Alpha helix;Red line:Extended strand;Purple line:Random coil圖7 AcCHI1的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7 Secondary structure prediction of AcCHI1

圖8 AcCHI1的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.8 Tertiary structure prediction of AcCHI1

2.4.7 三級(jí)結(jié)構(gòu)分析 三級(jí)結(jié)構(gòu)是指經(jīng)過充分折疊，能發(fā)揮生物活性、可以執(zhí)行特定生物催化功能的完整三維立體結(jié)構(gòu)。在對(duì)AcCHI1進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)同源建模時(shí)，以I類幾丁質(zhì)酶(4tx7.1.A)作為同源目標(biāo)模板，利用Swiss-Model軟件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)AcCHI1與同源模板結(jié)構(gòu)的相似度為69.67%，圖8為利用同源建模生成的AcCHI1的三維立體結(jié)構(gòu)。

3 討論

本研究首次從獼猴桃中克隆到幾丁質(zhì)酶基因AcCHI1(GenBank登錄號(hào)MH580296)，并利用生物信息學(xué)方法對(duì)AcCHI1蛋白的分子特征進(jìn)行了分析和預(yù)測(cè)。結(jié)果表明AcCHI1屬于19家族成員，同時(shí)屬于I類幾丁質(zhì)酶。目前，有關(guān)幾丁質(zhì)酶的分類方式主要有2種，一是根據(jù)幾丁質(zhì)酶催化區(qū)氨基酸序列同源性，將幾丁質(zhì)酶分為2個(gè)家族，即18家族和19家族。其中18家族幾丁質(zhì)酶來源于細(xì)菌、真菌、病毒及一些植物；19家族主要由植物幾丁質(zhì)酶構(gòu)成，同時(shí)在一些放線菌中也有發(fā)現(xiàn)[6-9]。二是根據(jù)氨基酸序列特征，將幾丁質(zhì)酶分成6類，即ClassⅠ～Ⅵ,其中的Ⅰ類幾丁質(zhì)酶因含有結(jié)合幾丁質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，增強(qiáng)了酶對(duì)底物的親和力，而具有強(qiáng)烈的抗真菌活性[10-12]?？梢钥闯?，本文將AcCHI1基因歸在19族與19族幾丁質(zhì)酶主要來自植物的結(jié)論是一致的，同時(shí)也表明AcCHI1基因很可能具有寶貴的應(yīng)用價(jià)值。

植物中并無(wú)幾丁質(zhì)，但幾丁質(zhì)酶普遍存在于植物中，顯然幾丁質(zhì)酶很可能參與植物防衛(wèi)反應(yīng)特別是參與植物對(duì)真菌病害的抗性反應(yīng)[13]，由此也引發(fā)了大量有關(guān)植物幾丁質(zhì)酶基因克隆、產(chǎn)物特性及應(yīng)用研究。目前，已從水稻、棉花、煙草、甘蔗、梨、菜豆、馬鈴薯、茶樹、菊花等100余種植物中克隆到幾丁質(zhì)酶基因[14-19]，并且在水稻、花生、黃瓜等多種植物中開展了轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因研究，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株不同程度增強(qiáng)了對(duì)一些真菌病害的抗病能力[14,20-21]。奉新縣大部分獼猴桃品種不抗果腐病，特別是‘紅陽(yáng)’、‘金果’等優(yōu)良品種果腐病發(fā)生嚴(yán)重[2]，獼猴桃?guī)锥≠|(zhì)酶基因的獲得將為從遺傳上改良這些品種以增強(qiáng)其對(duì)果腐病抗性帶來了希望。