張文琪 孫 甜 呂業(yè)超 唐小牛 郭 偉 湛孝東 周萍萍 姜玉新

(1.皖南醫(yī)學院生理學教研室，安徽 蕪湖 241002； 2.皖南醫(yī)學院醫(yī)學寄生蟲學教研室，安徽 蕪湖 241002)

過敏性哮喘(哮喘)是以嗜酸性粒細胞(EOS)浸潤、并伴有氣道高反應(yīng)性、可逆的氣道重塑以及黏液分泌增多為臨床特征的慢性氣道炎性疾病[1]，發(fā)病率呈上升趨勢。過敏性哮喘發(fā)病機理尚不十分清楚，目前認為輔助性T細胞亞群Th1、Th2、Treg和Th17等比例失衡及其分泌的細胞因子紊亂而引起的免疫失調(diào)所致[2]。巨噬細胞也參與機體免疫防御過程。研究發(fā)現(xiàn)，細胞因子IL-4和IL-13刺激可引起過敏性哮喘小鼠體內(nèi)的巨噬細胞向肺部募集，從而加速了肺部炎癥反應(yīng)[3]。另有研究顯示，過敏性哮喘小鼠體內(nèi)巨噬細胞數(shù)量較低，提示巨噬細胞可能有助于緩解過敏性哮喘癥狀[4]。目前以糖皮質(zhì)激素為主的短期治療和變應(yīng)原特異性免疫治療的脫敏療法為治療過敏性哮喘的主要手段5]。前者易復發(fā)，而后者則治療周期較長，且脫敏效果欠佳。

草烏甲素(Bulleyaconitine A，BLA)是從烏頭堿植物中提取的具有高活性的二酯C19-二萜類生物堿[6]。研究證明，BLA具有抗炎、抗過敏以及免疫調(diào)節(jié)等作用[7-8]。但其在過敏性哮喘的作用尚不清楚。因此，本研究擬探討B(tài)LA對OVA致敏的過敏性哮喘小鼠模型的抗炎作用及其可能的機理，以期為其治療過敏性哮喘的潛在作用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級BALB/c雌鼠60只(18～22 g)，購于蘇州工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司[許可證號:SCXK(蘇)2014-0007]。

1.1.2主要試劑 卵白蛋白(OVA)、草烏甲素標準品(BLA)、氫氧化鋁[Al(OH)3]購自美國Sigma公司；IgE、IgG、IL-4、TNF-α和MCP-1 ELISA檢測試劑盒購自南京建成生物工程有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗NF-κB1、PKC-δ多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.1.3主要儀器設(shè)備 超聲霧化儀(型號402AI)為江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司產(chǎn)品；電子分析天平(型號BS224S)為德國Sartorius公司產(chǎn)品；高速勻漿機(型號T10)為德國IKA公司產(chǎn)品；恒溫水浴鍋(型號SHKE6000-8CE)為美國Thermo公司產(chǎn)品；超純水儀(Milli-Q?Direct Water Purification System)為美國Millipore公司產(chǎn)品；多功能酶標儀(Tecan Infinite F200)為瑞士TECAN集團公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1過敏性哮喘小鼠模型的制備 將BALB/c雌性小鼠隨機分為6組，每組10只，分別為：陰性對照組(NC組)、哮喘組(AS組)、BLA-低劑量組(BLA-L組)、BLA中劑量組(BLA-M組)、BLA高劑量組(BLA-H組)和地塞米松陽性對照組(Dex組)。參照文獻[9]的方法制備過敏性哮喘小鼠模型：BALB/c雌性小鼠分別于第0、7及14天腹腔注射0.2 ml含10μg OVA的PBS[含2% Al(OH)3]霧化吸入激發(fā)，每天1次，每次30 min，持續(xù)霧化1周。霧化吸入前，BLA-L組、BLA-M組和BLA-H組小鼠分別給予劑量為0.16、0.32、0.48的BLA(溶于0.2 ml的PBS)進行腹腔注射；Dex組小鼠則給予劑量1 mg/kg的Dex(溶于0.2 ml的PBS)進行腹腔注射；NC組和AS組則用PBS代替進行霧化激發(fā)，且每次霧化吸入前腹腔注射0.2 ml PBS。

1.2.2血清IgE、IgG水平測定 末次激發(fā)24 h，每組小鼠取6只用異氟烷麻醉，收集全血于4 ℃靜置30 min后，4 ℃3000 r/min離心10 min，取上清用ELISA檢測試劑盒測定血清中IgE、IgG含量。操作按試劑盒說明書進行。

1.2.3肺泡灌洗液(BALF)中IL-4、IL-10、TNF-α與MCP-1的測定與細胞分類計數(shù) 末次激發(fā)24 h，取每組小鼠異氟烷麻醉后，行氣管插管，注入總體積為1 ml的PBS(按0.3、0.3、0.4)灌洗3次，回收率在0.75 ml以上為合格。4 ℃3000 r/min離心10 min；上清用ELISA試劑盒檢測細胞因子IL-4、TNF-α與MCP-1的水平。細胞沉淀用0.5 ml PBS重懸并調(diào)整細胞濃度為1.0×104/ml，并進行細胞涂片，干燥后進行瑞氏染色，光鏡下對嗜酸性粒細胞、淋巴細胞與巨噬細胞計數(shù)。

1.2.4肺組織病理學檢測 分離步驟1.2.2小鼠的肺組織，4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、酒精梯度脫水后切片，HE染色后，光學顯微鏡下觀察小鼠肺部病理結(jié)構(gòu)改變。

1.2.5NF-κB1、PKC-δ蛋白表達水平的檢測 取新鮮肺組織按1∶20的比例加入細胞裂解液，冰上超聲勻漿，4 ℃15000 r/min離心10 min，上清用BCA檢測試劑盒測定蛋白濃度后，用12.5%的SDS-PAGE分離膠分離，條件為：恒壓110V持續(xù)100 min；隨后，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：恒流400 mA 120 min。轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜用含5%的BSA封閉2 h，分別加入兔抗PKC-δ、NF-κB1和GAPDH一抗(稀釋比例1∶2000)4℃孵育過夜，TBS-T洗滌3～5次，加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗(稀釋比例1∶5000)孵育40 min，ECL試劑盒曝光成像。

2 結(jié) 果

2.1草烏甲素降低血清中IgG、IgE的水平

為了觀察草烏甲素對過敏性哮喘小鼠的治療效果，我們首先檢測了小鼠血清中總IgE、總IgG兩種抗體水平，結(jié)果如圖1A，NC組、AS組、BLA-L組、BLA-M組、BLA-H組、Dex組的血清總IgE分別為(15.67± 4.45)、(64.16±5.91)、(44.38±3.56)、(32.48±2.62)、(24.54±2.11)、(25.48±1.30)ng/ml，與哮喘組相比，草烏甲素治療組、Dex組IgE水平明顯降低(P<0.01)，其中用藥組中劑量最大者效果最為顯著。

圖1B顯示：NC組、AS組、BLA-L組、BLA-M組、BLA-H組、Dex組各組小鼠的血清總IgG含量分別為(12.20±0.67)、(34.38±2.08)、(25.41±1.19)、(18.66±0.78)、(17.70±0.63)、(15.72±0.46)ng/ml。與哮喘組相比，BLA-L組、BLA-M組、BLA-H組的IgG含量顯著降低(P<0.01)；而Dex組的IgG含量最低。

A：a，與AS組相比，P<0.01；b，與BLA-L組相比，P<0.01；c，與BLA-M相比，P<0.05。B：a，與AS組相比，P<0.01；b，與BLA-L組相比，P<0.01；c，與BLA-M組相比，P<0.01；d，與BLA-H組相比，P<0.05。

圖1 草烏甲素對血清總IgE、IgG的影響

2.2草烏甲素對BALF中IL-4、IL-10、TNF-α與MCP-1的影響

NC組、AS組、BLA-L組、BLA-M組、BLA-H組、Dex組的細胞因子IL-4水平分別為(169.07±2.60)、(339.47±2.52)、(298.82±3.86)、(277.89±7.53)、(277.81±5.98)、(276.67±4.36)pg/ml。與哮喘組相比,草烏甲素處理組灌洗液中IL-4的含量降低(P<0.01)；與BLA-L組相比，BLA-M組、BLA-H組與Dex組含量降低(P<0.01)；但BLA-M組、BLA-H組與Dex組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見圖2A。

NC組、AS組、BLA-L組、BLA-M組、BLA-H組、Dex組的細胞因子TNF-α水平分別為(215.70±13.75)、(454.25〗± 23.16)、(376.24±27.12)、(260.10±17.59)、(245.50±17.92)、(246.27±91.84)pg/ml。與哮喘組相比，草烏甲素處理組灌洗液中TNF-α含量顯著降低(P< 0.01)；與BLA-L組相比，BLA-M組與BLA-H組含量下降，BLA-M組與BLA-H組、Dex組之間無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，BLA-H組效果最佳。見圖2B。

NC組、AS組、BLA-L組、BLA-M組、BLA-H組、Dex組的細胞因子MCP-1水平分別為(336.15±37.81)、(670.64±52.74)、(630.68±37.66)、(410.39±10.97)、(518.13±25.20)、(360.97±21.66)pg/ml。與哮喘組相比，BLA-L組灌洗液中MCP-1含量下降(P< 0.05)，而BLA-M組與BLA-H組含量顯著減少(P< 0.01)；與BLA-L組相比，BLA-M組與BLA-H組含量下降(P<0.01)；與BLA-M組相比，BLA-H組含量增多(P<0.01)；與BLA-M組相比，Dex組MCP-1含量減少(P<0.05)。見圖2C。

2.3BALF中細胞計數(shù)情況

為了進一步了解草烏甲素對肺泡灌洗液中細胞數(shù)量的影響，我們對其進行分類計數(shù)。結(jié)果如圖3A： NC組、AS組、BLA-L組、BLA-M組、BLA-H組、Dex組嗜酸性粒細胞數(shù)分別為(0.39±0.03)、(5.58±0.22)、(3.05±0.17)、(1.87±0.17)、(1.46±0.16)、(1.29±0.20)×104/ml。草烏甲素處理組的嗜酸性粒細胞數(shù)量明顯低于哮喘組(P<0.01)；與BLA-H組相比，Dex組治療的效果更佳。

圖3B顯示：NC組、AS組、BLA-L組、BLA-M組、BLA-H組、Dex組淋巴細胞分別為(0.22±0.03)、(0.47±0.05)、(0.52±0.07)、(0.35±0.04)、(0.30±0.03)、(0.39±0.04)×104/ml，與哮喘組相比，BLA-M組、BLA-H組、Dex組淋巴細胞數(shù)量降低(P<0.05)，BLA-L組對淋巴細胞的抑制作用不顯著。

由圖3C可知：NC組、AS組、BLA-L組、BLA-M組、BLA-H組、Dex組巨噬細胞數(shù)分別為(0.87±0.45)、(4.85±0.34)、(2.36±0.36)、(1.75±0.20)、(1.13±0.19)、(1.25±0.26)×104/ml，草烏甲素處理組巨噬細胞數(shù)顯著低于哮喘組(P<0.01)。與BLA-L組相比，BLA-M組、BLA-H組及Dex組淋巴細胞減少(P<0.01)。BLA-H組與Dex組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4草烏甲素能夠減少氣道炎性細胞的浸潤以及氣道粘液分泌

為了分析草烏甲素治療過敏性哮喘小鼠對肺組織的影響，我們檢測了肺組織的病理變化。HE染色結(jié)果(圖4)顯示，NC組小鼠氣道周圍炎性細胞浸潤較少，肺泡上皮細胞與支氣管壁結(jié)構(gòu)較完整；而哮喘組小鼠氣道炎性細胞浸潤較為明顯，各劑量的草烏甲素處理組及地塞米松組氣道炎癥反應(yīng)均輕于哮喘組，嗜酸性粒細胞浸潤顯著減少。

A：a，與AS組相比，P<0.01；b，與BLA-L組相比，P<0.01。B：a，與AS組相比，P<0.01；b，與BLA-L組相比，P<0.01。C：a，與AS組相比，P<0.05；b，與AS組相比，P<0.01；c，與BLA-L組相比，P<0.01；d，與BLA-M組相比，P<0.01；e，與BLA-M組相比，P<0.05。

圖2 BLA對BLAF中IL-4、TNF-α和MCP-1的影響

A：a，與AS組相比，P<0.01；b，與BLA-L組相比，P<0.01；c，與BLA-M組相比，P<0.01。B：a，與AS組相比，P<0.05；b，與BLA-L組相比，P<0.01。C：a，與AS組相比，P<0.01；b，與BLA-L組相比，P<0.01；c，與BLA-M組相比，P<0.01；d，與BLA-M組相比，P<0.05。

圖3 各組小鼠BALF分類計數(shù)圖

圖4 小鼠肺組織病理形態(tài)(HE染色,×200)

2.5草烏甲素下調(diào)肺組織中NF-κB1、PKC-δ的表達

為了探討草烏甲素對過敏性哮喘抗炎作用的初步機制，我們分析了草烏甲素對NF-κB信號通路的影響。Western blot結(jié)果(圖5)顯示，在哮喘組中NF-κB1與PKC-δ較正常組表達明顯增加，而用草烏甲素處理后發(fā)現(xiàn)，NF-κB1與PKC-δ的表達均顯著減少。

A：a，與AS組相比，P<0.01；b，與BLA-L組相比，P<0.01；c，與BLA-M組相比，P<0.01；d，與BLA-H組相比，P<0.01。

B：a，與AS組相比，P<0.01；b，與BLA-L組相比，P<0.01；c，與BLA-M組相比，P<0.01；d，與BLA-H組相比，P<0.01。

圖5 草烏甲素減少NF-κB1與PKC-δ的表達

3 討 論

過敏性哮喘是一種氣道慢性炎癥性疾病，特征是氣道炎癥、IgE分泌增多、EOS數(shù)量增加、淋巴細胞浸潤以及黏液分泌增多[10-11]。其中，Th1/Th2細胞比例失衡是導致過敏性哮喘的主要原因[12]。此外，巨噬細胞也參與了過敏性哮喘氣道炎癥的發(fā)生[13]。

Bulleyaconitine A(BLA)是一種從烏頭屬植物中提取的二萜類生物堿。目前，針對BLA的生物學活性主要聚焦于其對疼痛的研究。研究發(fā)現(xiàn)，口服BLA可減輕紫杉醇誘導的大鼠脊髓背角C-纖維突觸的神經(jīng)病理性疼痛[14]。最新研究顯示，BLA優(yōu)選阻斷L5脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中的TTX-S鈉通道[15]以及Nav通道[16]從而緩解疼痛。也有研究發(fā)現(xiàn)，BLA可直接刺激脊髓小膠質(zhì)細胞分泌強啡肽而參與抗過敏作用[17]。但其在過敏性哮喘中的抗炎作用尚未見報道。

本研究結(jié)果表明，草烏甲素可顯著降低血清總IgE和總IgG水平，尤其是高劑量組效果更明顯。這說明草烏甲素與抗過敏作用密切相關(guān)。肺巨噬細胞通過分泌IL-4、TNF-α與MCP-1等炎性因子誘導炎癥反應(yīng)，在哮喘的發(fā)病機制中至關(guān)重要，與此同時，與該發(fā)病機制密切相關(guān)的蛋白已成為研究熱點[18-20]。在本課題的研究過程中，我們通過對BALF中的炎性因子IL-4、TNF-α與MCP-1等的檢測發(fā)現(xiàn)，不同濃度的草烏甲素均可明顯下調(diào)三者的水平，尤其是中高濃度效果更明顯。MCP-1是主要由巨噬細胞分泌的CC趨化因子蛋白家族成員之一，主要參與機體的抗炎作用[21]。研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者血清中MCP-1顯著高于正常人群[21]。這與我們的結(jié)果相一致，即BALF中MCP-1在AS組中的表達顯著高于NC組。而草烏甲素處理可顯著降低MCP-1的表達，我們推測草烏甲素可能導致巨噬細胞的數(shù)量下降引起的。通過檢測BALF中的巨噬細胞數(shù)量，我們進一步證實草烏甲素可以通過降低巨噬細胞的數(shù)量進而抑制MCP-1的表達。此外，草烏甲素的處理也降低了EOS和淋巴細胞數(shù)量，而這些細胞數(shù)量的下降也有助于緩解過敏性哮喘癥狀。

為了分析草烏甲素對NF-κB信號通路蛋白的影響，本課題檢測了這條通路的關(guān)鍵蛋白NF-κB1與PKC-δ在細胞質(zhì)中的表達，發(fā)現(xiàn)NF-κB1與PKC-δ蛋白在草烏甲素處理組小鼠中的表達低于OVA誘導的過敏性哮喘組小鼠，說明草烏甲素能夠通過NF-κB信號通路下調(diào)NF-κB1和PKC-δ蛋白在肺組織中的表達。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB參與了炎癥相關(guān)基因的表達調(diào)控[22]，在免疫、炎癥、細胞增殖中起著關(guān)鍵作用[23]。在過敏性哮喘發(fā)病過程中，刺激因素活化NF-κB信號通路后，可促進氣道上皮細胞因子如IL-4、TNF-α增加[24]，NF-κB的增加與疾病嚴重程度密切相關(guān)，重癥哮喘患者NF-κB的表達明顯升高[25]。在OVA誘導的過敏性哮喘小鼠模型，腹腔注射PKC-δ特異性抑制劑，可抑制氣道炎癥反應(yīng)和氣道高反應(yīng)[26]，說明PKC-δ的活化能夠抑制氣道炎癥和氣道重塑的形成[27]，這與本研究的結(jié)果一致，并且在本研究中得到了進一步驗證。

綜上所述，本研究通過動物實驗證明草烏甲素能夠減輕OVA誘導的過敏性哮喘，其機制可能是通過NF-κB信號通路減少PKC-δ/NF-κB1的蛋白表達。作為一種安全性能高的天然化合物有較高的應(yīng)用價值與前景。