王信林 宋 歌 王艷新 徐 剛 徐曉燕 王德才

(泰山醫(yī)學院藥學院，山東 泰安 271016)

乳腺癌是嚴重威脅女性健康與生命的惡性腫瘤之一，其死亡率為女性惡性腫瘤致死的首位。目前，綜合治療模式雖提高了乳腺癌患者的生存率，但仍有復發(fā)率高、毒副作用大等缺點。因此，尋找一種高效、毒副作用小的抗癌藥物成為目前抗腫瘤的研究熱點。

半枝蓮和白花蛇舌草分別為唇形科植物半枝蓮和茜草科植物白花蛇舌草的干燥帶根全草，均具有活血化瘀，清熱解毒以及抗癌等功效。兩者符合“七情和合”理論和組合原則，常以藥對的形式出現(xiàn)在各種經典方劑中，對腫瘤療效確切。研究表明，白花蛇舌草醇提物對白血病細胞株 HL-60[1]和結腸腺癌細胞株LS180[2]等細胞增殖均有抑制作用。半枝蓮提取物亦能誘導白血病K562細胞發(fā)生凋亡[3]。本課題通過MTT法和CCK法檢測半枝蓮與白花蛇舌草的醇提液是否對乳腺癌細胞的增殖具有抑制作用，探討二者分別對乳腺癌細胞MCF-7的作用，并觀察二者配伍對MCF-7增殖的影響，為白花蛇舌草與半枝蓮開發(fā)和臨床抗腫瘤治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

MCF-7細胞株 (生命科學學院王鳳澤老師惠贈);白花蛇舌草(中藥飲片，購自泰安市漱玉平民藥店)；半枝蓮(中藥飲片，購自泰安市漱玉平民藥店)；DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司產品)；CCK8試劑盒(江蘇凱基生物科技有限公司);MTT(Sigma公司);二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Scientific Heracell VIOS)、倒置相差生物顯微鏡(XDS-1B)、酶標儀(瑞士Tecan)。

1.2 方法

1.2.1白花蛇舌草70%乙醇提取物的制備 準確稱量粉碎后的白花蛇舌草100 g放入1000 ml圓底燒瓶中，加入600 ml 70%乙醇， 60 ℃回流提取3次，每次2 h，合并濾液。使用旋轉蒸發(fā)儀將濾液濃縮至浸膏狀，再將浸膏置于烘箱中60 ℃烘干至粉末。將粉末收集，置于冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2半枝蓮70%乙醇提取物的制備 準確稱量粉碎后的半枝蓮100 g放入1000 ml圓底燒瓶中，加入600 ml 70%乙醇， 60 ℃回流提取3次，每次2 h，合并濾液。使用旋轉蒸發(fā)儀將濾液濃縮至浸膏狀，再將浸膏置于烘箱中60 ℃烘干至粉末。將粉末收集，置于冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3MTT法檢測白花蛇舌草與半枝蓮醇提物對MCF-7細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的MCF-7細胞用胰蛋白酶消化，以含10%胎牛血清的DMEM制備為5×104個/ml細胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μl，細胞長至近單層后培養(yǎng)細胞，吸凈上層培養(yǎng)基，進行分組：(1)空白對照組：MCF-7細胞用不含藥的DMEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，復孔5個；(2)藥物處理組：MCF-7細胞用下列終濃度的含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)，每個藥物組各濃度均復孔5個。白花蛇舌草醇提物溶液濃度分別為：50，100，200，400 μg/ml；半枝蓮醇提物溶液濃度分別為：25，50，100，200 μg/ml。(3)在二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h后吸凈培養(yǎng)基，在培養(yǎng)細胞的每孔中加入100 μl MTT溶液，然后繼續(xù)在恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h后，棄上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜溶解細胞內結晶。用酶標儀在490 nm波長測定吸光度值。

1.2.4CCK法檢測白花蛇舌草與半枝蓮醇提物配伍對MCF-7細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的細胞用MCF-7細胞胰蛋白酶消化，以含10%胎牛血清的DMEM制備為5×104個/ml細胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μl，細胞長至近單層后培養(yǎng)細胞，吸凈上層培養(yǎng)基，進行分組：(1)空白對照組：MCF-7細胞用不含藥的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)正常培養(yǎng)，復孔5個；(2)藥物處理組：MCF-7細胞用最終濃度為白花蛇舌草和半枝蓮醇提物兩者配伍處理：終濃度分別為25，50，100 μg/ml的含藥培養(yǎng)基每孔100 μl繼續(xù)培養(yǎng)，每個藥物組5個復孔；(3)在二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h后吸凈培養(yǎng)基，在培養(yǎng)細胞的每孔中加入100 μl PBS緩沖液，再加入CCK試劑10 μl，繼續(xù)在恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h后，用酶標儀測定在450 nm波長下的吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 白花蛇舌草和半枝蓮醇提物對MCF-7細胞增殖的影響

與空白對照組比較，白花蛇舌草和半枝蓮醇提物各劑量組能不同程度的抑制MCF-7細胞的增殖，且呈現(xiàn)明顯劑量-效應關系。見表1、2。

表1 白花蛇舌草醇提物對MCF-7細胞增殖的影響

注：與空白對照組比較，**P<0.01。

表2 半枝蓮醇提物對MCF-7細胞增殖的影響

注：與空白對照組比較，**P<0.01。

2.2 白花蛇舌草醇提物與半枝蓮醇提物配伍(1∶1配伍)對MCF-7細胞增殖的影響

與空白對照組比較，白花蛇舌草醇提物與半枝蓮醇提物配伍組能不同程度的抑制MCF-7細胞的增殖，且呈現(xiàn)明顯劑量-效應關系。見表3。

表3 白花蛇舌草醇提物與半枝蓮醇提物配伍對MCF-7細胞增殖的影響

注：與空白對照組比較，**P<0.01。

3 討 論

白花蛇舌草和半枝蓮因其生理活性的多樣性、復雜性和高效性而備受諸多學者的關注，特別是在抗腫瘤方面，療效確切[4-8]。由本次實驗結果亦可清晰地看出，與空白對照組比較，不同濃度的白花蛇舌草醇提物及半枝蓮醇提物都能不同程度的抑制MCF-7細胞的增殖，且呈現(xiàn)明顯劑量-效應關系，表明兩種藥物的醇提物具有一定的抗腫瘤活性，可能與其抑制腫瘤細胞增殖有關。同時，對白花蛇舌草醇提物及半枝蓮醇提物進行1∶1配伍，結果顯示較單獨使用時對于MCF-7細胞增殖的抑制作用更明顯，表明白花蛇舌草及半枝蓮的配伍應用可能較單用作用增強，具體機制不明確。

中藥配伍理論是中醫(yī)理論的精華，兩種或多種藥物配伍應用，既可避免單向用藥的副作用，同時還可提高方劑療效并縮短病程產生系統(tǒng)優(yōu)勢，全面兼顧病情。中藥復方藥代動力學研究表明，藥物配伍能明顯影響藥物成分的動力學參數(shù)，且與藥物的療效和毒性相關。中藥進入人體進而發(fā)揮多成分、多靶點、多途徑的作用，必會引起整個生命網絡中分子、細胞、器官、整體多個層面結構與功能狀態(tài)的變化，而這些變化必然會體現(xiàn)在相關代謝物在量上的改變。根據中醫(yī)理論和中藥的作用過程，推測白花蛇舌草-半枝蓮配伍作用過程可能發(fā)生在下列環(huán)節(jié)：(1)藥劑學環(huán)節(jié)，配伍前后活性成分的變化；(2)藥動學環(huán)節(jié)，機體對配伍前后活性成分的吸收、代謝過程變化；(3)藥效學環(huán)節(jié)，配伍前后對藥效的增強作用。因此，要闡明白花蛇舌草-半枝蓮配伍的作用機制，就要針對上述3個環(huán)節(jié)進行整體研究，整體闡明白花蛇舌草-半枝蓮配伍的物質基礎和作用機理。因此，今后在對白花蛇舌草-半枝蓮藥對的研究中，從配伍前后活性成分吸收、代謝等環(huán)節(jié)，闡明白花蛇舌草-半枝蓮配伍的可能機理，并為白花蛇舌草和半枝蓮配伍應用于臨床提供科學依據。