陳娜，林盧奇，毛銀，趙運英，鄧禹*

1(江南大學，糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫,214122) 2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫,214122)

D-葡萄糖二酸(D-glucaricacid)作為非常重要的有機酸已被廣泛研究，其在醫(yī)療和工業(yè)中有著廣泛的應用，比如降膽固醇、治療糖尿病、腫瘤治療等等[1]，或可能用作聚合物前體，包括新型尼龍和高度分支聚酯。目前已經(jīng)有利用產(chǎn)自葡萄糖的葡萄糖二酸制備羥基化尼龍的報道，羥基化尼龍是可生物降解的纖維[2-3]。在美國太平洋西北國家實驗室、國家再生能源實驗室和美國能源部寫的一份報告中，葡萄糖二酸被認為是“topvalue-addedchemicalfrombiomass”。由于該有機酸的重要性，正越來越得到學術界和工業(yè)界的重視。

目前生產(chǎn)葡萄糖二酸的方法主要以化學法為主，即葡萄糖的化學氧化，采用硝酸作為溶劑和氧化劑，這是一個非選擇性、高成本的過程[4]?；瘜W法的主要問題是低得率，只有不到40%；需要高溫；會產(chǎn)生大量氧化反應副產(chǎn)物，不利于后續(xù)葡萄糖二酸的分離[5]。生物法合成葡萄糖二酸相較于傳統(tǒng)的化學法，有著很多的優(yōu)勢，比如環(huán)境更加友好，更大地實現(xiàn)低成本生產(chǎn)的可能性。生物法產(chǎn)葡萄糖二酸有很多種途徑[6-8]。在合適的菌種中構(gòu)建高效穩(wěn)定的葡萄糖二酸合成途徑，應用于工業(yè)生產(chǎn)，取代傳統(tǒng)的化學途徑，將是非常有前景的研究領域[9-10]。

早在2009年，PRATHER領導的研究團隊就在大腸桿菌中構(gòu)建了葡萄糖到葡萄糖二酸的代謝途徑，首次實現(xiàn)葡萄糖二酸在微生物中的合成[11]。通過表達不同生物來源的肌醇加氧酶(myo-inositoloxygenase，MIOX)和糖醛酸脫氫酶(uronatedehydrogenase，UDH)基因，5步反應即實現(xiàn)大腸桿菌中葡萄糖到葡萄糖二酸的轉(zhuǎn)化。在LB培養(yǎng)基中，搖瓶發(fā)酵時葡萄糖二酸產(chǎn)量最高達到1.13g/L，轉(zhuǎn)化率最高可達17.4%。由于葡萄糖二酸發(fā)酵時的低pH值對大腸桿菌具有毒害作用，PRATHER教授的團隊還將葡萄糖二酸的合成途徑從大腸桿菌轉(zhuǎn)移到釀酒酵母中[12]。在該研究中，表達擬南芥來源的肌醇氧化酶MIOX4和丁香假單胞菌來源的糖醛酸脫氫酶UDH，以葡萄糖為底物，葡萄糖二酸最大產(chǎn)量分別為：分批發(fā)酵0.56g/L，補料分批發(fā)酵0.98g/L，而添加60mmol/L肌醇后補料分批發(fā)酵1.6g/L。

本研究以釀酒酵母為宿主，構(gòu)建葡萄糖二酸的合成途徑，選擇在釀酒酵母中穩(wěn)定表達的miox4基因[13-14]，構(gòu)建游離型質(zhì)粒表達系統(tǒng)，針對質(zhì)粒表達的不穩(wěn)定性采用整合多拷貝delta位點表達miox4和udh，最終提高葡萄糖二酸的產(chǎn)量，為葡萄糖二酸的實際發(fā)酵生產(chǎn)應用奠定堅實的基礎

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 主要儀器和試劑

梯度PCR儀，美國Bio-Rad公司；小型電泳槽，美國Bio-Rad公司；液相色譜儀，上海精密科學儀器有限公司分析儀器總廠；5810R型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司。

Prime STAR DNA Polymerase，ExTaqDNA Polymerase，T4 DNA Ligase，限制性內(nèi)切酶等均購自寶生物工程(大連)有限公司；SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒，膠回收試劑盒等購自生工生物工程(上海)股份有限公司，其他試劑均為市售國產(chǎn)或進口分析純產(chǎn)品，目的基因miox4和udh及引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.1.2 菌種和質(zhì)粒(表1)

本研究所用菌株和質(zhì)粒如表1所示。

表1 本研究所用菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.3 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，葡萄糖20 g/L。固體培養(yǎng)基添加20 g/L瓊脂粉。

SD-URA/SD-HIS培養(yǎng)基：酵母氮源1.7 g/L，葡萄糖20 g/L，硫酸銨5 g/L，補加適量的必須氨基酸。固體培養(yǎng)基添加20 g/L瓊脂粉。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，葡萄糖20 g/L。固體培養(yǎng)基添加20 g/L瓊脂粉。

1.2 方法

1.2.1 基因合成及PCR擴增

由美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)獲得來自擬南芥的肌醇加氧酶基因miox4和丁香假單胞菌的udh，經(jīng)過密碼子優(yōu)化,由蘇州金唯智生物公司合成得到pUC57-miox4-udh。以此質(zhì)粒為模板，分別擴增肌醇合成途徑關鍵酶基因miox4、udh。本研究使用的引物見表2。

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

注：下劃線序為融合PCR互補序列。

1.2.2 敲除OPI1基因

以pUG6質(zhì)粒為模板擴增敲除框(含loxp-kan-loxp組件)，敲除框帶有OPI1基因上下游各50 bp堿基作為同源臂。用醋酸鋰化學轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化釀酒酵母BY4741感受態(tài)，涂布G418抗性平板，2 d后長出單菌落。用引物OPI1kochkF和OPI1kochkR和菌落PCR驗證得到正確條帶，將正確菌株搖瓶培養(yǎng)至對數(shù)期，提取基因組驗證。以此菌株做感受態(tài)，轉(zhuǎn)化pSH65質(zhì)粒，半乳糖誘導Cre切除抗性基因KanMX4，驗證切除正確后，在YPD液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代以丟失質(zhì)粒pSH65，獲得敲除OPI1基因的菌株BY4741opi1Δ。

1.2.3 質(zhì)粒構(gòu)建

選擇組成型質(zhì)粒pY26，在其多克隆位點BglII/NotI插入miox4片段，得到pY26-miox4質(zhì)粒，利用Gibson Assembly組裝構(gòu)建pY26-miox4-udh；用NcoI和XhoI分別雙酶切pY26質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物，由T4連接酶過夜連接，得到pY26-miox4-6×His。

1.2.4 Western blot

重組菌Bga-1在SD-URA培養(yǎng)基中培養(yǎng)到OD600值為0.6～0.8,按10%的接種量轉(zhuǎn)接在50 mL的SD-URA培養(yǎng)基，以帶有質(zhì)粒pY26的菌株作為空白對照。培養(yǎng)24 h，進行Western blot驗證蛋白是否表達。將pY26-miox4-6×His轉(zhuǎn)化釀酒酵母BY4741opi1Δ,在YPD中培養(yǎng)24 h。收集菌體提取蛋白測酶活，總蛋白質(zhì)濃度測定按照Bradford法，以BSA為標準。

1.2.5 整合delta位點片段的構(gòu)建

以釀酒酵母基因組為模板，用genF-1/genR-1和genF-6/genR-6為引物分別擴增delta1和delta2片段，以上述質(zhì)粒pY26-miox4-udh為模板，用genF-2/genR-2和genF-5/genR-5為引物分別擴增miox4和udh表達原件，以質(zhì)粒pRS313為模板，用genF-3/genR-3和genF-4/genR-4為引物分別擴增組氨酸篩選標記表達元件HIS1和HIS2。將上述PCR產(chǎn)物膠回收，用降落PCR方法將delta1、miox4表達原件、HIS1和HIS2、udh表達原件、delta2融合成帶有同源臂delta1和delta2的2個片段，如圖1所示。

1.2.6 MIOX4酶活測定

圖1 整合菌酵母構(gòu)建示意圖Fig.1 Construction of the engineering yeast strain

離心收集菌體重懸于50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)緩沖液，冰浴超聲破碎20 min，4 ℃離心l0 min，Bradford法測定上清液中蛋白質(zhì)濃度并測定酶活?？偡磻w積200 μL：50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)，2.0 mmol/LL-半胱氨酸，1.0 mmol/L硫酸亞鐵銨，60 mmol/L肌醇，一定量酶液。

反應體系加入肌醇后于室溫反應1 h，煮沸15 min終止反應，離心取上清，用Orcinol reagent顯色法測定葡萄糖醛酸的濃度。Orcinol reagent：100 mL 37% HCl，0.1 g地衣酚，0.1 g FeCl3。1體積的反應液與2體積的Orcinol reagent在沸水浴中加熱30 min，冷卻至室溫后測定OD660值，通過比對標準曲線獲得葡萄糖醛酸的含量，酶活實驗以不添加肌醇的反應體系作為對照，進而測定酶活[15]。1個酶活力單位：將l min內(nèi)能轉(zhuǎn)化1 nmol肌醇所需的酶量定義為1個酶活單位。

1.2.7 培養(yǎng)方法

挑取單菌落接種到10 mL YPD液體培養(yǎng)基中，250 r/min，30 ℃過夜培養(yǎng)至OD600值約為5.0左右，按初始OD600值約為0.1轉(zhuǎn)接至裝有50 mL液體YPD培養(yǎng)基(含60 mmol/L肌醇)的250 mL錐形瓶中，在發(fā)酵進行到24 h和48 h時，分別補加5 g/L的葡萄糖[12]，進行補料分批發(fā)酵240 h。

1.2.8 有機酸等代謝產(chǎn)物的檢測

發(fā)酵液離心取上清液,用規(guī)格0.22 μm的濾膜過濾后，取濾液。即可通過液相色譜-質(zhì)譜連用(LC-MS)檢測，或通過高效液相色譜(HPLC)檢測[12]。

2 結(jié)果和分析

2.1 敲除OPI1阻遏基因

在釀酒酵母中，從葡萄糖開始合成肌醇的生物合成與代謝途徑基本明晰。在肌醇的合成過程中，肌醇-1-磷酸合成酶是關鍵酶，該酶的編碼基因為INO1，是酵母中受控制最嚴格的基因之一。報道稱肌醇-1-磷酸合成酶的表達受到其產(chǎn)物肌醇的反饋抑制，抑制過程通過阻遏因子基因OPI1來完成[16]。因此，要實現(xiàn)肌醇的過量積累，必須敲除OPI1這個轉(zhuǎn)錄負調(diào)控基因。最終成功敲除OPI1得到釀酒酵母BY4741opi1Δ菌株，如圖2所示。敲除后的菌株與原始野生菌株BY4741相同條件下進行發(fā)酵，肌醇的積累量為0.69 g/L，與野生型菌株相比明顯提高，如圖3所示。

M-5 000 bp DNA marker;1-對照菌株1 602 bp； 2-含有OPI1敲除組件的菌株，2 025 bp;3- kan標記被消除的菌株圖2 基因OPI1的敲除和PCR驗證Fig.2 Confirmation the deletion of gene OPI1 by PCR

圖3 OPI1基因敲除前后肌醇產(chǎn)量對比Fig.3 Comparison of myo-inositol yield before and after the deletion of OPI1

2.2 葡萄糖二酸生產(chǎn)途徑關鍵基因表達驗證

研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖二酸合成途徑中肌醇氧化酶是限速步驟，來源于小鼠的肌醇氧化酶極不穩(wěn)定，在培養(yǎng)基加60 mmol/L肌醇的培養(yǎng)條件下6 h達到最高酶活，之后急劇下降[11]，找到更加穩(wěn)定高效的肌醇氧化酶是提高葡萄糖二酸產(chǎn)量的關鍵因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中存在一條以肌醇為底物的合成途徑，肌醇氧化酶是這個途徑中的關鍵酶[13-14]，對擬南芥中的肌醇氧化酶進行酶活性質(zhì)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶活較高，遠高于隱球菌酵母、豬類動物[18]，這為尋找更加合適的肌醇氧化酶提供了思路。

將來源于擬南芥的肌醇氧化酶基因miox4經(jīng)過密碼子優(yōu)化并融合表達1個組氨酸標簽，通過構(gòu)建質(zhì)粒pY26-miox4-6×His在酵母中表達，將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母BY4741opi1Δ得到菌株Bga-1,以釀酒酵母BY4741opi1Δ攜帶pY26質(zhì)粒為對照，發(fā)酵24 h。將樣品提取總蛋白并調(diào)節(jié)蛋白濃度一致，做Western blot驗證，結(jié)果如圖4所示，大小為37 kDa，與理論值相符[18]，說明miox4基因成功表達。

圖4 MIOX4蛋白Western blot檢測結(jié)果Fig.4 Western blot analysis of MIOX4

2.3 葡萄糖二酸游離表達菌株發(fā)酵驗證

以釀酒酵母BY4741opi1Δ為出發(fā)菌株，將本研究構(gòu)建好的表達載體pY26-miox4-udh經(jīng)LiAc高效轉(zhuǎn)化法導入BY4741opi1Δ，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，得到重組菌Bga-2。對重組菌Bga-2進行搖瓶發(fā)酵實驗，以BY4741opi1Δ為對照組，發(fā)酵240 h左右，把樣品處理后經(jīng)LC-MS質(zhì)譜檢測，結(jié)果如圖5所示，說明導入葡萄糖二酸合成外源基因的釀酒酵母可以實現(xiàn)葡萄糖二酸的生產(chǎn)。

圖5 LC-MS檢測葡萄糖二酸標準品(a)和發(fā)酵樣品(b)Fig.5 LC-MS detection of glucaric acid (a) and fermentation sample (b)

經(jīng)過質(zhì)譜檢測之后，發(fā)酵樣品經(jīng)過高效液相檢測，結(jié)果如圖6所示，葡萄糖二酸積累量可達0.54 g/L，但是產(chǎn)量較低，如何提高產(chǎn)量是后續(xù)實驗的主要目標。

圖6 Bga-2菌株在YPD培養(yǎng)基中發(fā)酵結(jié)果Fig.6 Fermentation profile of Bga-2 strain in YPD medium

2.4 葡萄糖二酸合成途徑delta位點整合型酵母菌株的構(gòu)建

考慮到產(chǎn)量比較低，原因可能是游離質(zhì)粒不穩(wěn)定易丟失。由于釀酒酵母表達系統(tǒng)比較復雜，能夠使用的載體類別非常有限。本實驗采用的質(zhì)粒pY26即為YEP型，這類質(zhì)粒常用于釀酒酵母中異源蛋白的表達，但此類質(zhì)粒會因釀酒酵母的有絲分裂而急劇下降導致外源基因丟失。為解決外源基因丟失，表達不穩(wěn)定現(xiàn)象及增加目的基因整合位點拷貝數(shù)，有一些新方法，如以delta序列為整合位點的DNA重組技術[19-20]。

利用delta序列同源重組方法，將外源基因整合到釀酒酵母染色體組的效率比傳統(tǒng)的方法高許多，且目的基因表達穩(wěn)定，為人工構(gòu)建釀酒酵母基因組整合表達模塊提供了思路。綜合以上考慮，本研究基于釀酒酵母delta序列，構(gòu)建了一個以delta序列為整合位點并且包含GPD和TEF強啟動子以組氨酸標簽為篩選標記的2個DNA片段，將miox4和udh整合到釀酒酵母的染色體進行外源表達。將融合好的2個片段用LicA高效轉(zhuǎn)化法導入釀酒酵母細胞內(nèi)，由于這2個片段各自帶有組氨酸篩選標記基因序列的一部分，利用同源重組原理，這2個片段整合成功的菌株可以在SD-HIS的平板上生長即為陽性克隆子。在SD-HIS平板上挑取單菌落培養(yǎng)提取基因組進行PCR驗證，以菌株BY4741opi1Δ為對照，如圖7所示，整合成功的菌株命名為Bga-3。

M-10 000 Marker；條帶1-Bga-3；條帶2-對照菌株圖7 delta位點整合PCR驗證Fig.7 Confirmation the correct construction of the delta site integration by PCR

將Bga-3進行補料分批發(fā)酵，取發(fā)酵后的樣品通過液相色譜檢測葡萄糖二酸產(chǎn)量，發(fā)酵結(jié)果如圖8所示，葡萄糖二酸產(chǎn)量可達3.80 g/L，產(chǎn)量是Bga-2菌株的7.17倍。

圖8 Bga-3菌株發(fā)酵結(jié)果Fig.8 Fermentation profile of Bga-3 strain in YPD medium

2.5 肌醇氧化酶的酶活分析

MOON等[11]全合成老鼠來源的肌醇氧化酶基因序列，將其克隆在高效表達質(zhì)粒pTrc上，并轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)進行表達，比酶活達430 U/mg。但是得出小鼠來源的肌醇氧化酶活性極不穩(wěn)定，在培養(yǎng)基加60 mmol/L肌醇的培養(yǎng)條件下6 h達到最高酶活，之后急劇下降，是葡萄糖二酸代謝途徑的限制因素之一。因此本研究選擇酶活更加穩(wěn)定高效的擬南芥來源的肌醇氧化酶MIOX4。

本研究對游離質(zhì)粒表達的菌株和整合delta位點的菌株進行MIOX4的比酶活測定，培養(yǎng)條件相同，培養(yǎng)基均為YPD培養(yǎng)基中添加60 mmol/L肌醇。結(jié)果如圖9所示。

圖9 Bga-2和Bga-3中MIOX4的比酶活Fig.9 MIOX4 specific activity in Bga-2 strain and Bga-3 strain with 60 mmol/L myo-inositol

Bga-3中MIOX4比酶活在36 h達到最高為2 050 U/mg,之后比酶活逐漸降低并維持在500 U/mg之上，與游離質(zhì)粒表達的最高酶活295 U/mg相比，整合表達的MIOX4更穩(wěn)定，不管是質(zhì)粒表達還是整合表達，在釀酒酵母中，肌醇氧化酶的活性都沒有出現(xiàn)急劇下降至酶活很低的狀況，而是酶活在逐漸下降并維持在一定活力之上。

3 結(jié)論

為了積累葡萄糖二酸的前體物質(zhì)肌醇，運用loxP-kanMX4-loxP系統(tǒng)敲除了肌醇合成途徑中阻遏基因OPI1。外源基因通過游離質(zhì)粒表達，在釀酒酵母中成功構(gòu)建葡萄糖二酸合成途徑，獲得菌株Bga-2。YPD培養(yǎng)基中添加60 mmol/L肌醇、在24、48 h補加5 g/L葡萄糖的培養(yǎng)條件下，葡萄糖二酸產(chǎn)量為0.54 g/L。

本研究選擇酵母基因組中的delta位點作為整合位點進行外源基因的過表達，獲得整合表達表達菌株Bga-3，增加外源基因的拷貝數(shù)。與游離質(zhì)粒表達菌株Bga-2比較，相同培養(yǎng)條件下，葡萄糖二酸產(chǎn)量明顯提高，為3.80 g/L。分別對游離質(zhì)粒表達的菌株Bga-2和整合表達菌株Bga-3中MIOX4的比酶活進行測定，結(jié)果顯示delta位點整合表達菌株中的MIOX4比酶活遠高于游離質(zhì)粒表達菌株。