高曉雯, 周施雨, 卞竹箐, 王清華, 戴錫玲

(上海師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234)

0 引 言

我國蕨類植物資源豐富,約有2600種,占全世界蕨類總數(shù)的1/5.STOKEY[1-2]研究了多種蕨類植物配子體的發(fā)育過程,證實了其中的孢子萌發(fā)類型、配子體發(fā)育類型及成熟原葉體形態(tài)[3-5]在探討蕨類科、屬分類和系統(tǒng)演化方面具有一定的價值.但是,相對于種子植物,有些蕨類植物配子體性狀表現(xiàn)不穩(wěn)定,易受環(huán)境條件影響而變化,例如,環(huán)境光的顏色、光照強(qiáng)度和溫度對蕨類植物孢子萌發(fā)、配子體生長、假根生長及兩性配子體的形成具有一定的影響[6-10].而水分條件對配子體形態(tài)發(fā)育的影響未見報道.

利用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)烏毛蕨(Blechnumorientale)孢子[11],其孢子萌發(fā)時間較混合土培的明顯縮短,絲狀體長度更長,假根細(xì)長[12].用含水量較大的Knop′s瓊脂培養(yǎng)基和混合土對普通針毛蕨(Macrothelypteristorresiana)孢子進(jìn)行培養(yǎng)[13],土培配子體在接種后35 d可觀察到精子器,而在含水量較大的Knop′s瓊脂培養(yǎng)基上的配子體產(chǎn)生精子器則需要60 d左右.采用MS(Murashige and Skoog)培養(yǎng)基、混合土和吸水濾紙分別培養(yǎng)傅氏鳳尾蕨(Pterisfaurieisp.)孢子[14],發(fā)現(xiàn)其配子體的形態(tài)與培養(yǎng)方式有關(guān),MS培養(yǎng)基與土培的配子體假根粗短.以上研究結(jié)果表明,不同的水分條件可能是影響蕨類植物配子體形態(tài)發(fā)育的重要因素之一,對蕨類植物配子體形態(tài)中絲狀體形態(tài)、假根長短及性器官分化等存在一定影響.

本文依據(jù)PPG-1(2016)蕨類植物分類系統(tǒng)[15],選取薄囊蕨類(Polypodiidae)中莎草蕨目(Schizaeales)海金沙科(Lygodiaceae)海金沙[Lygodiumjaponicum(Thunb.) Sw.],水龍骨目(Polypodiales)中真水龍骨類(Eupolypods):真水龍骨類I(Eupolypods I)鳳尾蕨科(Pteridaceae)水蕨[Ceratopteristhalictroides (L.) Brongn],真水龍骨類II(Eupolypods II)烏毛蕨科(Blechnaceae)狗脊[Woodwardiajaponica(L.f.) Sm.]3種不同演化地位的蕨類植物,其中海金沙、水蕨配子體的形態(tài)發(fā)育已有報道[16-17].利用改良Knop′s瓊脂培養(yǎng)基,在其余環(huán)境條件完全相同的條件下,設(shè)置3組不同的水分條件,對3種蕨類植物配子體進(jìn)行培養(yǎng);利用光學(xué)顯微鏡對3種蕨類的孢子萌發(fā)、絲狀體、片狀體、原葉體、性器官和假根等形態(tài)特征進(jìn)行詳細(xì)觀察,旨在進(jìn)一步明確蕨類植物配子體形態(tài)發(fā)育過程中不受水分條件影響的穩(wěn)定性狀,為蕨類植物配子體發(fā)育和分類演化研究提供基礎(chǔ)資料.

1 材料和方法

1.1 材 料

海金沙(L.japonicum)于2013年7月采自浙江寧波;水蕨(C.thalictroides)于2013年9月采自上海師范大學(xué)奉賢校區(qū)植物園;狗脊(W.japonica)于2013年8月采自浙江西天目山.將帶有成熟孢子的3種蕨類植物葉片置于潔凈紙袋中,放于干燥通風(fēng)處,使孢子自然散落,約1周后將孢子去雜并收集于硫酸紙袋中.

1.2 方 法

在超凈工作臺上將5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))次氯酸鈉溶液加入放有適量孢子的離心管中充分振蕩搖勻,浸泡5 min后離心(2000 r·s-1,3 min).去上清液,加入無菌水,振蕩離心.重復(fù)3次.在離心管中加入無菌水,配制孢子懸浮液.用膠頭滴管吸取1 mL孢子懸浮液,均勻涂布接種在平板培養(yǎng)基上(涂布密度小于100 mL-1),再按照無水、加入1管水(約2 mL)和2管水(約4 mL)分為3組,分別標(biāo)記為組1、組2、組3,置于ZGX-300C型人工培養(yǎng)箱(浙江錢江儀器設(shè)備有限公司制造)中培養(yǎng),全天光照,光照強(qiáng)度約為2000 lx,溫度為(25±2) ℃,濕度為60%～75%.

定期利用Nikon SMZ1500型光學(xué)顯微鏡觀察并記錄、照相.實驗重復(fù)3次,文中數(shù)據(jù)為3次觀察的平均值,用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水分條件下3種蕨類植物配子體的形態(tài)發(fā)育

2.1.1 海金沙配子體的形態(tài)發(fā)育

海金沙孢子接種后,組1、組2、組3的孢子萌發(fā)時間分別為16,14,11 d左右.海金沙孢子萌發(fā)類型為密穗蕨型(Anemia type)[18].

孢子萌發(fā)后形成絲狀體.比較了不同水分條件下海金沙配子體的發(fā)育形態(tài),如圖1所示.由圖1可知:組1的絲狀體大多為單列細(xì)胞,長度為50～65 μm;組2和組3的絲狀體則具有單列細(xì)胞和雙列細(xì)胞兩種形態(tài),且絲狀體長度為50～100 μm,明顯大于組1的長度.絲狀體頂端細(xì)胞經(jīng)過多次縱裂,向兩側(cè)擴(kuò)展,呈分散生長形成片狀體,片狀體進(jìn)一步發(fā)育成心臟型原葉體,海金沙原葉體發(fā)育類型為鐵線蕨型(Adiantum type)[18].

當(dāng)原葉體上產(chǎn)生性器官,表明原葉體已成熟.3個組都出現(xiàn)了雌性原葉體和雄性原葉體,雄性原葉體上精子器出現(xiàn)的時刻都早于雌性原葉體上頸卵器出現(xiàn)的時刻,兩種原葉體形態(tài)具有較大差異.海金沙接種約4周后,組3配子體首先出現(xiàn)精子器,約2 d后其余兩組也相繼出現(xiàn)精子器.精子器混生于假根叢中、兩翼下部及近中肋,近球形,直徑約為50～60 μm.3組產(chǎn)生的精子器的形態(tài)、大小無差異,且雄性原葉體的數(shù)量比3組雌性原葉體產(chǎn)生的數(shù)量多.海金沙接種9周左右后,組3最先出現(xiàn)頸卵器,頸卵器頂面觀為銅錢狀,且組3中雌性原葉體的數(shù)量多于組2和組1的.

海金沙配子體發(fā)育過程中,組1次生假根,始終粗短;組3次生假根細(xì)長;組2次生假根的長度介于組1和組3的長度之間.每組選取10個樣本進(jìn)行測量,計算長度平均值,對組2和組1、組3和組1的次生假根長度進(jìn)行顯著性分析比較,結(jié)果如表1所示,組3、組2的次生假根長度與組1的具有極顯著差異性(p<0.01).

2.1.2 水蕨配子體的形態(tài)發(fā)育

水蕨孢子接種后,組1、組2和組3的孢子萌發(fā)時間分別為7,6,5 d左右,水蕨孢子萌發(fā)類型為書帶蕨型(Vittaria type)[18].

接種9 d后,3個組絲狀體發(fā)育大小不同.比較了不同水分條件下水蕨配子體的發(fā)育形態(tài),如圖2所示.由圖2可知,組2和組3的絲狀體長度明顯大于組1的,組1的絲狀體長度為(65.6±8.3) μm,組2的絲狀體長度為(114.7±38.6) μm,組3的絲狀體長度為(170.9±11.2) μm,絲狀體形狀均呈長條形.對組2和組1、組3和組1的絲狀體長度進(jìn)行了顯著性分析比較,如上述結(jié)果所示,組3、組2絲狀體長度與組1具有極顯著差異性(p<0.01).

接種約12 d后,水蕨配子體進(jìn)入片狀體階段,隨后發(fā)育成略不對稱的心臟型原葉體.水蕨原葉體發(fā)育類型為水蕨型(Ceratopteris type)[18].組1大多為雄性配子體,呈長條形;組2、組3大多為兩性配子體或雌性配子體.

水蕨接種約4周后,組3首先出現(xiàn)精子器,約2 d后其余兩組也相繼出現(xiàn)精子器.精子器的出現(xiàn)同樣早于頸卵器.精子器大多著生于原葉體邊緣;接種5周后,組3首先出現(xiàn)頸卵器,多發(fā)生于原葉體生長點下方的中脈范圍內(nèi).

組1的次生假根總體較短;組2的次生假根較長,組3的次生假根最長.對組2和組1、組3和組1的次生假根長度進(jìn)行顯著性分析比較,由表1可知:組3、組2的次生假根長度與組1的具有極顯著差異性(p<0.01).

圖1 不同水分條件下海金沙配子體發(fā)育形態(tài)比較

表1 不同水分條件下海金沙、水蕨和狗脊配子體次生假根長度比較 μm

注:p<0.01代表具有極顯著差異性

圖2 不同水分條件下水蕨配子體形態(tài)發(fā)育比較

2.1.3 狗脊配子體的形態(tài)發(fā)育

狗脊孢子接種后組1、組2、組3的孢子萌發(fā)時間分別為18,14,10 d左右,孢子壁從裂縫處裂開,長出初生假根以及含有葉綠素的原葉體原始細(xì)胞.狗脊孢子萌發(fā)類型為書帶蕨型(Vittaria type)[18].

原葉體原始細(xì)胞橫裂均形成單列絲狀體.比較了不同水分條件下狗脊配子體的發(fā)育形態(tài),如圖3所示.由圖3可知,組1、組2絲狀體長度約為50～80 μm;組3絲狀體最長,為85～110 μm.絲狀體繼續(xù)發(fā)育,大多形成倒梯形片狀體.片狀體發(fā)育形成的原葉體基部微收,邊緣不平滑.在組3中明顯可觀察到:相隔幾個細(xì)胞便有一個細(xì)胞凸出,單細(xì)胞棒狀毛狀體長在突出細(xì)胞的頂端.組1大部分成熟原葉體展開時寬約800～1200 μm,組2的寬約1000～1500 μm,組3的寬約1000～1800 μm.狗脊原葉體發(fā)育類型為三叉蕨型(Aspidium type)[18].

狗脊配子體為兩性配子體.接種約6周后,組3首先出現(xiàn)精子器,約4 d后其余2組也相繼出現(xiàn)精子器.接種7周左右,組3首先出現(xiàn)頸卵器.

在狗脊整個配子體發(fā)育過程中,組1的次生假根粗短,組3的細(xì)長,組2的介于兩者之間.對組2和組1、組3和組1的次生假根長度進(jìn)行了顯著性分析比較,由表1可知:組3、組2的次生假根長度與組1的都具有極顯著差異性(p<0.01).當(dāng)配子體生長到成熟原葉體時期,組1的次生假根直徑約為20 μm,組2的約為17 μm,組3的與組2的較為接近.

各組成熟原葉體形狀沒有差別,但在水分充足時,原葉體邊緣毛狀體下方細(xì)胞分裂,毛狀體更突出,組1產(chǎn)生毛狀體數(shù)量最少,長度為(8.9±0.5) μm,一個原葉體約有5～15個毛狀體.組2的毛狀體長度為(18.3±0.9) μm,一個原葉體約有10～23個毛狀體.組3產(chǎn)生毛狀體數(shù)量最多,毛狀體長度為(20.3±1.1) μm,一個原葉體約有15～30個毛狀體,發(fā)育最發(fā)達(dá).對3個組所測數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析,結(jié)果顯示,組3、組2的毛狀體長度與組1的具有極顯著差異性(p<0.01),說明水分條件對毛狀體長度有影響.

圖3 不同水分條件下狗脊配子體形態(tài)發(fā)育比較

2.2 不同水分條件對3種蕨類植物配子體形態(tài)發(fā)育的影響

通過以上對比觀察,發(fā)現(xiàn)不同水分條件對3種蕨類植物配子體形態(tài)發(fā)育的影響表現(xiàn)在以下幾個方面:

1) 對孢子萌發(fā)速率的影響:海金沙、水蕨和狗脊的孢子萌發(fā)速率不盡相同,但均在水分最為充足時(組3)萌發(fā)最早,而在沒有水分時(組1)萌發(fā)最慢.

2) 對絲狀體長度的影響:在水分充足的條件下,3種蕨類植物形成的絲狀體長度最長,且海金沙在水分充足時易出現(xiàn)多列細(xì)胞的絲狀體.

3) 對配子體性別表現(xiàn)的影響:在缺水或水分不足條件下,3種蕨類容易形成雄性配子體,而在水分充足條件下,形成雌配子體的概率較大.

4) 對假根和毛狀體的影響:水分充足時,3種蕨類的配子體上次生假根更長,毛狀體更發(fā)達(dá)且數(shù)量更多;缺水時配子體上次生假根較短,毛狀體數(shù)量較少.

3 討 論

3種蕨類的孢子萌發(fā)類型及配子體發(fā)育類型不受水分條件的影響[16-17].在水分充足時,海金沙、狗脊和水蕨孢子萌發(fā)速率明顯較快,這與烏蕨(Stenolomachusanum)的情況相同[11-12];狗脊和水蕨的絲狀體長度更長,這與金毛裸蕨(Clematischrysocoma)、中華桫欏(Alsophilacostularis)和扇蕨(Neocheiropterispalmatopedata)的情況相同[7-8,10,16-17,19].另外,在海金沙組中還出現(xiàn)了進(jìn)一步發(fā)育的雙列細(xì)胞絲狀體.在水分充足時,狗脊配子體產(chǎn)生毛狀體數(shù)量更多、發(fā)育更好,即毛狀體數(shù)量及發(fā)育程度會受水分條件影響[20],但毛狀體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定[21].3種蕨類植物配子體的次生假根生長受水分條件影響較大[22],在水分不足的情況下,蕨類配子體次生假根基部膨大、末端分叉,而本實驗結(jié)果表明:蕨類配子體假根在水分充足時較長,在缺水時較短.觀察海金沙和水蕨的配子體發(fā)育發(fā)現(xiàn):經(jīng)歷不適條件或環(huán)境脅迫時,蕨類植物多發(fā)育為雄配子體[19,23];而在適宜條件下易發(fā)育形成雌性配子體或兩性配子體[24].這樣使蕨類植物在逆境條件下趨于產(chǎn)生大量精子,提高受精率,有利于物種的生存[8,24].

4 結(jié) 論

通過設(shè)置3個不同的水分梯度并控制其他環(huán)境影響條件,研究了海金沙、水蕨和狗脊3種不同演化地位的蕨類植物的配子體形態(tài)發(fā)育過程.結(jié)果表明:不同水分條件對不同演化地位的蕨類植物配子體發(fā)育形態(tài)都具有一定影響.在水分充足時,孢子萌發(fā)速率更快,絲狀體長度更長,性器官分化形成雌性配子體的概率更大,次生假根更長,毛狀體更發(fā)達(dá)且數(shù)量更多;在水分不足時,孢子萌發(fā)速率較慢,絲狀體較短,形成雄性配子體的概率更大,次生假根較短,毛狀體數(shù)量較少.若將上述特征作為蕨類植物分類鑒定的依據(jù),需要嚴(yán)格控制其外部環(huán)境.孢子萌發(fā)類型、配子體發(fā)育類型、成熟原葉體形態(tài)及毛狀體形態(tài)結(jié)構(gòu)不受水分條件的影響,是穩(wěn)定的配子體特征性狀,可以作為蕨類植物分類演化研究的依據(jù).