王雪瑩 謝聰聰 姚冠峰 郭曉麗 綜述 劉效群 審校

河北省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院(石家莊，050071)

線粒體位于真核生物細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，是有氧呼吸及產(chǎn)生ATP的主要場所，被稱為細(xì)胞的核電站，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生一定數(shù)量的活性氧(ROS)。線粒體受損時(shí)，釋放大量的ROS和細(xì)胞凋亡因子，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，線粒體損傷是細(xì)胞凋亡和壞死的重要途徑[1]。線粒體是一種半自助性的細(xì)胞器，具有自己的遺傳物質(zhì)線粒體DNA(mtDNA)，能獨(dú)立復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯13種線粒體蛋白，其余必要的蛋白質(zhì)需要細(xì)胞核DNA編碼。線粒體是母系遺傳，子代的mtDNA大部分來源于母親，因此，可利用母親的線粒體方法追蹤家族譜系。對于mtDNA基因突變的患者，可用捐贈(zèng)者正常的mtDNA替換有缺陷的mtDNA，此技術(shù)已應(yīng)用在輔助生殖技術(shù)中[2]。

1 線粒體的功能

1.1 氧化磷酸化

線粒體是細(xì)胞進(jìn)行氧化磷酸化和合成ATP的主要場所，也是糖類、脂質(zhì)和氨基酸等物質(zhì)最終氧化釋能的場所。糖類和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中通過降解產(chǎn)生丙酮酸和脂肪酸，在氧化磷酸過程中這些物質(zhì)進(jìn)入線粒體基質(zhì)，經(jīng)過一系列分解代謝形成乙酰輔酶A，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和黃素腺嘌呤二核苷酸遞氫體(FADH2)脫氫，經(jīng)線粒體內(nèi)膜的呼吸鏈逐級傳遞，最終傳遞給氧。在氧化磷酸化過程中，會(huì)生成少量ROS，但在線粒體內(nèi)源性抗氧化機(jī)制下可以抵消[3]。

1.2 內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)

在氧化磷酸化過程中，電子傳遞鏈會(huì)產(chǎn)生少量以超氧化物自由基形式存在的ROS。在電子傳遞鏈中，電子流動(dòng)可以減少超氧離子(O2-)。線粒體中的錳超氧化物歧化酶(MnSOD)，可以將過氧化氫氧化成低活性過氧化氫。過氧化氫可以發(fā)生芬頓反應(yīng)，產(chǎn)生的羥基自由基(OH-)損傷脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸。存在于線粒體膜間隙的谷胱甘肽(GSH)過氧化物酶可以將過氧化氫轉(zhuǎn)化為水。損傷的線粒體可以增加內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的活性。例如，NADH缺乏會(huì)增加了MnSOD的表達(dá)，從而將超氧化物轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞中的過氧化氫[4]。

1.3 鈣緩沖

電子跨線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生一個(gè)負(fù)跨膜電勢，為陽離子進(jìn)入基質(zhì)提供強(qiáng)大的驅(qū)動(dòng)力，促使內(nèi)膜上的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將Ca2+移至線粒體內(nèi)，從而改變胞液Ca2+濃度，這對于Ca2+參與細(xì)胞內(nèi)各種信號通路極其重要。研究發(fā)現(xiàn)線粒體內(nèi)膜具有選擇性屏障作用，線粒體外膜具有調(diào)節(jié)Ca2+的屏障作用。在正常情況下，細(xì)胞質(zhì)中Ca2+的濃度為0.1μM，細(xì)胞外的Ca2+濃度為1mM，這種濃度差有利于Ca2+進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[5]。線粒體內(nèi)膜潛在-180mv電壓，有利于Ca2+流入到胞質(zhì)，直到線粒體基質(zhì)內(nèi)的Ca2+濃度比細(xì)胞質(zhì)高106才達(dá)到平衡。一旦Ca2+進(jìn)入胞質(zhì)，就克服了陽離子強(qiáng)大的驅(qū)動(dòng)力。重要的是，Ca2+需要不同的新陳代謝酶來激活，例如丙酮酸脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶。鈣離子流入線粒體基質(zhì)促進(jìn)新陳代謝，通過與這些代謝酶相互作用加速新陳代謝，增加細(xì)胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生[6]。

1.4 線粒體功能障礙及其機(jī)制

線粒體功能障礙多指因線粒體膜受到破壞，呼吸鏈?zhǔn)芤种?，酶活性降低，mtRNA的損傷等引起的能量代謝障礙，進(jìn)而導(dǎo)致一系列相互作用的損傷過程。線粒體功能障礙可使呼吸鏈酶活性下降，線粒體膜電位降低，ATP合成減少，細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)破壞，線粒體離子通透性改變，脂肪酸的β-氧化受阻，細(xì)胞內(nèi)脂肪酸蓄積，氧化應(yīng)激增加，mtDNA氧化損傷導(dǎo)致線粒體生物合成降低，進(jìn)一步加重線粒體功能障礙，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或死亡[7]。

線粒體功能障礙與許多疾病相關(guān)，例如卵巢儲(chǔ)備功能減退、糖尿病、帕金森病、阿爾茨海默癥、腫瘤、脂肪肝、肌肉萎縮癥、黃斑變性和神經(jīng)退化及其并發(fā)癥等。在某些疾病中，mtRNA基因缺陷會(huì)導(dǎo)致線粒體功能紊亂，引起正常的線粒體電子傳遞鏈損傷。線粒體功能障礙也涉及許多創(chuàng)傷性的病變，包括心肌梗死、中風(fēng)、腦外傷和脊椎損傷[8]。

2 線粒體與生殖

線粒體是母系遺傳，因?yàn)榫泳€粒體蛋白泛素化并在進(jìn)入卵母細(xì)胞后通過蛋白酶體和自噬進(jìn)行降解，但造成這種現(xiàn)象的機(jī)制尚不清楚。有學(xué)者認(rèn)為精子線粒體的程序性凋亡是為了保護(hù)胚胎免受其攜帶的異常突變的影響，因?yàn)榫影l(fā)生過程是暴露在高活性氧中。也有可能是精子線粒體的自行退化保護(hù)子代免受精子線粒體在進(jìn)入卵母細(xì)胞形成較高水平的異質(zhì)性[9]。

線粒體的數(shù)量和活性在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中與細(xì)胞周期不同步，而是隨胚胎發(fā)育進(jìn)程而改變，其異常將導(dǎo)致卵子和胚胎質(zhì)量低下。線粒體在生殖嵴的原始生殖細(xì)胞中只有不到10個(gè)，卵原細(xì)胞中達(dá)到200個(gè)，初級卵母細(xì)胞約有6000個(gè)，而在成熟的卵細(xì)胞中則增加到10萬個(gè)以上。在胚胎發(fā)育過程中，每個(gè)胚胎細(xì)胞的線粒體數(shù)量隨著胚胎分裂而減少，但胚胎的線粒體總量保持穩(wěn)定，直至囊胚期開始增多。排卵前卵母細(xì)胞線粒體處于靜息狀態(tài)，形態(tài)呈圓形或梨形，幾乎沒有嵴，基質(zhì)濃密且內(nèi)外膜并置；排卵后、卵子受精至囊胚階段，線粒體伸長，嵴逐漸出現(xiàn)并增多。在多數(shù)哺乳動(dòng)物胚胎著床前線粒體處于靜息狀態(tài)，發(fā)育至囊胚階段其結(jié)構(gòu)完整，功能活躍，并重啟復(fù)制，為后續(xù)胚胎發(fā)育提供能量[10]。

線粒體在生殖中起著非常重要的作用，大量研究表明，mtDNA異質(zhì)性與機(jī)體機(jī)能減退或衰老以及許多疾病相關(guān)。研究表明，小鼠高mtDNA異質(zhì)性水平能夠降低雌性個(gè)體繁殖水平，導(dǎo)致雌性不育，降低小鼠壽命以及影響其大腦發(fā)育，表明高水平mtDNA異質(zhì)性能夠減弱機(jī)體機(jī)能[11]。mtDNA異質(zhì)性水平隨年齡增大而增加，但mtDNA 突變累積與衰老之間的因果關(guān)系尚不明確。誘導(dǎo)mtDNA突變的轉(zhuǎn)基因小鼠生育能力嚴(yán)重下降。線粒體異質(zhì)體會(huì)影響人類卵母細(xì)胞的生育能力[12]。并且線粒體對調(diào)節(jié)受精過程中的鈣振蕩起著關(guān)鍵的作用，鈣振蕩對于胚胎的發(fā)育是至關(guān)重要的。當(dāng)線粒體功能受到抑制時(shí)，鈣振蕩模式就會(huì)發(fā)生改變[13]。此外，線粒體功能和DNA含量決定了受精的結(jié)果。線粒體DNA含量也與人類卵母細(xì)胞受精有關(guān)。在哺乳動(dòng)物中未受精的卵母細(xì)胞具有較低的mtDNA拷貝數(shù)，而退化的卵母細(xì)胞的拷貝數(shù)更少。在哺乳動(dòng)物受精失敗的卵母細(xì)胞中，mtDNA的數(shù)目較少，這可能提示細(xì)胞質(zhì)成熟障礙[14]。

豬卵母細(xì)胞中，mtDNA拷貝數(shù)和線粒體活性對孤雌激活起著重要作用；然而，mtDNA拷貝數(shù)似乎對豬卵母細(xì)胞成熟并不重要，但線粒體膜缺失會(huì)造成卵母細(xì)胞成熟障礙[15]。在體外受精過程中，mtDNA拷貝數(shù)發(fā)生改變會(huì)影響胚胎發(fā)育，但似乎不影響卵母細(xì)胞的成熟。在小鼠中，線粒體活性對于卵母細(xì)胞的成熟和后期的胚胎發(fā)育非常重要。另一研究表明，小鼠卵母細(xì)胞中抑制線粒體氧化磷酸化會(huì)嚴(yán)重降低其發(fā)育為囊胚的幾率[16]，也有研究表明，雖然小鼠的mtDNA拷貝數(shù)較低，足以支持受精和植入前發(fā)育，但胚胎植入后發(fā)育潛能不佳[17]。在植入后，小鼠胚胎發(fā)育所需的線粒體mtDNA拷貝數(shù)閾值為40 000～50 000。在人類中，卵母細(xì)胞具有高水平的ATP與優(yōu)質(zhì)胚胎率和種植率有關(guān)[18]?；谶@些研究，可認(rèn)為卵母細(xì)胞成熟需要較多的線粒體，卵母細(xì)胞中一定數(shù)量的線粒體對于支持胚胎的早期發(fā)育是必不可少的。

隨著年齡的增加，卵母細(xì)胞的質(zhì)量下降，胚胎非整倍體數(shù)量明顯增加。研究表明，隨著小鼠年齡的增加，卵母細(xì)胞產(chǎn)生的ATP數(shù)量下降，衰老的小鼠和倉鼠的卵母細(xì)胞ATP和mtDNA拷貝數(shù)均減少，線粒體的超微結(jié)構(gòu)異常[19]。Burgestaller[20]檢測了39個(gè)健康母親的多種線粒體等位基因，發(fā)現(xiàn)子代線粒體異質(zhì)性與母親妊娠的年齡成正相關(guān)，表明隨著年齡的增加，卵母細(xì)胞mtDNA累計(jì)的突變量會(huì)遺傳給子代。

3 線粒體移植

線粒體功能障礙與各種生育障礙相關(guān)。卵胞質(zhì)移植技術(shù)已應(yīng)用于胚胎發(fā)育不良和胚胎反復(fù)種植失敗的患者中。1997—2001年，約有30個(gè)孩子因此技術(shù)出生。因涉及倫理問題，有些國家(美國)禁止此項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于臨床，只有印度、新加坡、德國等一些國家允許開展此項(xiàng)技術(shù)[21]。

3.1 線粒體替代法

隨著顯微操作技術(shù)的不斷發(fā)展和胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查技術(shù)的廣泛應(yīng)用，線粒體替代法(MRT)為阻斷線粒體疾病的子代遺傳和改善卵母細(xì)胞質(zhì)量提供了新的手段。

3.1.1原核移植原核移植(PNT)是指在患者和供者的MⅡ期卵子同時(shí)行ICSI，并在患者和供者同時(shí)形成原核時(shí)，將患者的雙原核取出，轉(zhuǎn)移至去核的供體受精卵中。1980年初，McGrath等[22]將在小鼠受精卵中應(yīng)用PNT技術(shù)，并成功產(chǎn)生后代。1990年Ato等[23]首次提出運(yùn)用PNT技術(shù)預(yù)防m(xù)tDNA疾病。用異常受精的卵子探索人類受精卵中PNT的潛力。此技術(shù)上是可行的并且在體外可發(fā)育到囊胚。最近研究表明運(yùn)用PNT技術(shù)可增加有活力的受精卵數(shù)量，受精卵在核轉(zhuǎn)移后線粒體突變殘留不到2%，可有效降低缺陷性線粒體的數(shù)量，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于迄今研究疾病的突變閾值[24]。因此，PNT有減少線粒體疾病發(fā)生的潛力，具有臨床應(yīng)用前景。

3.1.2細(xì)胞質(zhì)移植細(xì)胞質(zhì)移植是指行ICSI的同時(shí)將少量年輕女性卵子的細(xì)胞質(zhì)注入高齡不孕女性卵子內(nèi)，能有效提高其妊娠率。細(xì)胞質(zhì)移植技術(shù)能提高卵母細(xì)胞質(zhì)量和早期胚胎發(fā)育能力，改善反復(fù)體外受精失敗患者的臨床結(jié)局。1997年，卵胞質(zhì)移植技術(shù)首次應(yīng)用于大齡不孕患者并獲得成功[25]。2015年Cree隨訪17例患者中，出現(xiàn)了2例特納綜合征和1例廣泛性發(fā)育障礙，認(rèn)為線粒體的異質(zhì)性或許通過表觀遺傳影響子代性狀，或許由操作本身影響染色體的穩(wěn)定性，給子代帶來即時(shí)或長期的健康隱患[24]。2015年世界第一例線粒體捐贈(zèng)的嬰兒在英國誕生。

3.1.3紡錘體移植目前最有前景的策略是在MII阻滯的卵母細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移核基因組。MII期卵母細(xì)胞染色體不封閉在核膜內(nèi)，而是在MII紡錘體軸上對齊，等待精子穿越透明帶，啟動(dòng)MII后期。普通顯微鏡看不到紡錘體或染色體，標(biāo)準(zhǔn)做法是使用液晶雙折射觀察紡錘體軸。然而，這方法可能導(dǎo)致染色體排列不整齊或分散。盡管這項(xiàng)技術(shù)具有挑戰(zhàn)性，但已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)恒河猴卵母細(xì)胞進(jìn)行MII紡錘體移植(MST)后出生的恒河猴未檢測到攜帶mtDNA的突變。后續(xù)人類卵母細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明MST會(huì)攜帶少量的mtDNA突變，但是MST卵母細(xì)胞受精會(huì)有原核數(shù)目異常的高發(fā)生率(48%)[26]。

3.2自體生殖細(xì)胞線粒體移植

自體生殖細(xì)胞線粒體移植(AUGMENT)以自體細(xì)胞為材料，減輕了倫理問題且操作簡單而備受關(guān)注[27]。這個(gè)替代方法增加了卵母細(xì)胞線粒體數(shù)量，也可通過去線粒體自溶注入來提高卵母細(xì)胞的性能。Tzeng等[28]在2001年首次報(bào)道，使用患者自體顆粒細(xì)胞線粒體移植至卵細(xì)胞進(jìn)行輔助生殖并獲得妊娠?？琢罴t等[29]也報(bào)道，通過AUGMENT已使多例患者獲得了臨床妊娠并分挽。加拿大OvaScience 公司分離患者卵巢干細(xì)胞并從中提取線粒體進(jìn)行自體卵細(xì)胞移植，成功誕下第一位“干細(xì)胞嬰兒”。 通過行自體線粒體移植，給卵母細(xì)胞提供補(bǔ)充了受精和繼續(xù)發(fā)育所需的能量，明顯改善了胚胎的質(zhì)量，并提高了妊娠率，是治療線粒體異常導(dǎo)致的卵巢儲(chǔ)備功能減退引起不孕或多次胚胎移植失敗患者的有效方法[15]。

4 倫理問題

英國已成為世界上第一個(gè)正式加入歐盟線粒體捐獻(xiàn)的國家。2015年10月在英國人類受精和胚胎學(xué)管理局的許可下成立線粒體捐贈(zèng)機(jī)構(gòu)，這對于有嚴(yán)重線粒體缺陷的家庭生育健康的寶寶提供了極大的幫助。2016年美國專家小組提出要遵守接受線粒體捐贈(zèng)者只能生育男嬰這一準(zhǔn)則，從而避免了捐贈(zèng)的線粒體遺傳其后代[30]。

捐贈(zèng)者與接受者的關(guān)系存在倫理困境。線粒體攜帶自身DNA，因此，接受捐贈(zèng)的孩子，會(huì)與三方有基因聯(lián)系:孩子的父母和捐贈(zèng)者。目前，已有幾例利用卵胞質(zhì)移植技術(shù)的孩子出生。這些人和他們的捐贈(zèng)者并未試圖相互聯(lián)系。但這些案例的數(shù)量較少，不具有完全的說服力。已有接受者表示不會(huì)把捐贈(zèng)者視為第二位母親。事實(shí)上，線粒體捐贈(zèng)者的DNA占比僅為0.1%，不考慮捐贈(zèng)者為第二位母親是合理的。參考器官捐獻(xiàn)的經(jīng)驗(yàn)，孩子和捐贈(zèng)者可能會(huì)在未來產(chǎn)生聯(lián)系對方的想法。因此需要在法律層面規(guī)范線粒體捐贈(zèng)技術(shù)，以保證相關(guān)信息的保密性和聯(lián)系方式的可及性。

線粒體自體移植則可降低組織mtDNA突變的風(fēng)險(xiǎn)，并且技術(shù)不涉及倫理問題，但這對于生物技術(shù)是一項(xiàng)巨大的挑戰(zhàn)，需要進(jìn)一步的復(fù)雜實(shí)驗(yàn)和使用動(dòng)物模型來慢慢地建立發(fā)展起來[31]。

綜上所述，線粒體作為重要的能量代謝細(xì)胞器，對卵細(xì)胞成熟、受精及胚胎著床前發(fā)育都具有重要作用。應(yīng)用現(xiàn)有的細(xì)胞生物學(xué)及分子遺傳學(xué)手段，找出合適的線粒體來源供體，結(jié)合卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射，對低質(zhì)量卵細(xì)胞進(jìn)行有效線粒體移植，可以明顯改善卵細(xì)胞的質(zhì)量和胚胎發(fā)育潛能，從而開啟因卵巢儲(chǔ)備功能減退而難以生育的治療新篇章。