鄒龑，杜源，傅風(fēng)華，

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 250014；2.煙臺大學(xué)藥學(xué)院，煙臺 264005)

卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)是最常見的腦血管疾病并發(fā)癥，是卒中后出現(xiàn)的以思維緩慢、情感低落、語言動作遲滯為主要表現(xiàn)的情感障礙性疾病[1]，其卒中后發(fā)病率29%～70%[2]。PSD是一種繼發(fā)性情感障礙，嚴(yán)重阻礙患者肢體功能和認(rèn)知功能恢復(fù)，增加病死率[3]。針對PSD本虛標(biāo)實(shí)的特點(diǎn)，臨床治療中多應(yīng)用疏肝益氣、活血解郁法組方用藥[4-5]。

PSD的發(fā)病機(jī)制尚不明確。經(jīng)典的單胺遞質(zhì)假說認(rèn)為PSD的發(fā)生與去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)、多巴胺(dopamine，DA)及5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)單胺遞質(zhì)的水平降低密切相關(guān)[6]。此外，5-羥色胺1A受體(5-HT1Areceptor，5-HT1AR)在大腦海馬內(nèi)分布最為廣泛，且與抑郁發(fā)生密切相關(guān)，是臨床抑郁癥藥物治療的重要靶點(diǎn)[7]。目前臨床上以選擇性5-羥色胺再攝取抑制藥(selective serotonin reuptake inhibitor，SSRIs)為一線用藥，例如西酞普蘭、氟西汀等[8-9]。解郁安神顆粒(JieyuAnshengranule，JY)為中藥成方制劑，其處方組成為柴胡、大棗、石菖蒲、半夏(制)、白術(shù)(炒)、浮小麥、遠(yuǎn)志(制)、甘草(炙)、梔子(炒)、百合、膽南星、郁金、龍齒、酸棗仁(炒)、茯苓、當(dāng)歸。其功效為疏肝解郁，安神定志。本研究旨在評價(jià)JY對PSD小鼠抑郁樣行為學(xué)，以及對海馬單胺神經(jīng)遞質(zhì)水平及5-HT1AR表達(dá)的影響，研究其抗抑郁作用及機(jī)制，為JY的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 無特定病原體(SPF)級昆明種小鼠，雄性，8周齡，體質(zhì)量30～35 g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育公司提供，許可證號：SYXK(魯)20140007。自由攝食和飲水，飼養(yǎng)環(huán)境22～24 ℃，相對濕度為40%～60%。

1.2藥品與試劑 JY(通化利民藥業(yè)集團(tuán)有限公司，規(guī)格：每袋5 g，批號：140607；艾司西酞普蘭片(丹麥靈北藥廠生產(chǎn)，西安楊森制藥有限公司分裝，規(guī)格：每片10 mg，批號：151218117)；水合氯醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號 ：20130426)；羧甲基纖維素鈉(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20110809)。去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)(批號：100169-201404)、DA(批號：100070-201507)及5-HT(批號：111656-200401)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.3方法 PSD小鼠模型參照相關(guān)文獻(xiàn)[10-11]，采用雙側(cè)頸總動脈線栓再灌聯(lián)合慢性不可預(yù)知性溫和刺激(chronic unpredicted mild stress，CUMS)制備。具體操作：動物用烏拉坦麻醉后固定，頸部用聚維酮碘消毒，在其正中線作一縱行切口，鈍性分離皮膚以及皮下組織，分離雙側(cè)頸總動脈，用止血鉗夾閉雙側(cè)頸總動脈阻斷血流5 min，隨后松開止血鉗使血復(fù)灌10 min，再次用止血鉗夾閉雙側(cè)頸總動脈阻斷血流5 min，隨后松開止血鉗，將切口縫合，消毒操作區(qū)域。在腦缺血后第2天起，進(jìn)行CUMS以建立PSD模型，包括：4 ℃ 冰水游泳、過夜照明、禁水、禁食、夾尾、潮濕墊料及合籠。共計(jì)7種刺激方法。每天1或2種，連續(xù)刺激18 d。除正常對照組外，將PSD模型小鼠隨機(jī)均分為模型對照組，艾司西酞普蘭組(5 mg·kg-1)，JY 小、中、大劑量組(JY0.75，1.50及3.00 g·kg-1)，每組12只。正常對照組及模型對照組給予空白溶媒(0.5%羧甲基纖維素鈉)，其余各組每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥28 d，給藥體積均為10 mL·kg-1。

1.4抑郁樣行為學(xué)檢測

1.4.1強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)在第20天進(jìn)行。正式實(shí)驗(yàn)前小鼠在實(shí)驗(yàn)室首先適應(yīng)環(huán)境至少1 h，然后將小鼠放入強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)裝置(高35 cm，直徑15 cm的透明圓柱形桶，水深35 cm)，使小鼠在水中前爪攀附于缸壁，并且不能以后爪支撐身體為標(biāo)準(zhǔn)，15 min后取出動物。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，將動物置于強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)裝置，保持水溫(25±2) ℃。觀察6 min，記錄后5 min內(nèi)累計(jì)不動時(shí)間。

1.4.2懸尾實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)在第21天進(jìn)行。采用小鼠專用懸尾箱(30 cm×30 cm×40 cm，內(nèi)有固定吊環(huán))，距尾尖2 cm處用醫(yī)用膠布固定于吊環(huán)上，使其頭部距離地面15 cm。實(shí)驗(yàn)時(shí)懸掛6 min，記錄累計(jì)不動時(shí)間。

1.5小鼠海馬NE、DA及5-HT水平檢測 給藥結(jié)束后，將小鼠處死，取腦，于冰上迅速剝離海馬組織，稱濕重，以1：9加入0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(PBS)，充分勻漿，再向勻漿液中加入其二分之一體積的6%高氯酸，充分渦旋， 4 ℃下16 000 r·min-1離心20 min(r=7.1 cm)。吸取上清液100 μL，過孔徑0.45 μm濾膜濾過后用高效液相色譜法進(jìn)行檢測。

色譜條件：色譜柱為SHIMADZU VP-ODS C18柱(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；水相為0.01 mol·L-1醋酸鉀緩沖液，流動相為甲醇-水(10：90)，用0.2 mol·L-1檸檬酸調(diào)pH值至4.0等度洗脫；柱溫為25 ℃；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長：275 nm。NE，DA及5-HT的保留時(shí)間分別為3.37，5.02及10.08 min。

1.6小鼠海馬5-HT1AR表達(dá)檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠處死，取腦，于冰上迅速剝離海馬組織，稱取海馬組織20 mg，加入RIPA裂解液250 μL，于冰上勻漿，4 ℃下12 000 r·min-1離心5 min(r=7.1 cm)，收集上清液，即為蛋白，測定蛋白濃度。隨即將上清液加入5倍上樣緩沖液，煮沸10 min。10% SDS-PAGE凝膠電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，隨即5%脫脂奶粉溶液封閉2 h，加入5-HT1AR一抗于4 ℃過夜孵育。TBST洗膜10 min × 3 次，加入二抗常溫孵育1 h，同法洗膜，放入凝膠成像系統(tǒng)，曝光攝像。圖像分析用ImageQuant LAS 4000軟件計(jì)算吸光度值(A)。

2 結(jié)果

2.1JY對PSD小鼠抑郁樣行為的影響

2.1.1JY對PSD小鼠游泳不動時(shí)間的影響 見圖1，與正常對照組比較，模型對照組小鼠游泳不動時(shí)間明顯增加(P<0.01)。與模型對照組比較，艾司西酞普蘭組及JY小及中劑量組小鼠游泳不動時(shí)間明顯減少(P<0.05)，JY大劑量組小鼠游泳不動時(shí)間有一定程度減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明PSD小鼠絕望不動的時(shí)間明顯增加，其表現(xiàn)出明顯的絕望情緒；而給藥后PSD小鼠不動時(shí)間減少，說明艾司西酞普蘭及JY(小、中劑量)均能明顯改善PSD小鼠的絕望情緒。

與正常對照組比較，*1P<0.05；與模型對照組比較，*2P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.05；Compared with model control group，*2P<0.05

2.1.2JY對PSD小鼠懸尾不動時(shí)間的影響 見圖2，與正常對照組比較，模型對照組小鼠懸尾不動時(shí)間明顯增加(P<0.01)。與模型對照組比較，艾司西酞普蘭組及JY中、大劑量組小鼠懸尾不動時(shí)間明顯減少(P<0.05)。結(jié)果表明PSD小鼠絕望不動時(shí)間明顯增加，其表現(xiàn)出明顯的絕望情緒；而給藥后PSD小鼠的不動時(shí)間減少，說明艾司西酞普蘭組及JY(中、大劑量)均能明顯改善PSD小鼠的絕望情緒。

2.2JY對PSD小鼠海馬NE、DA及5-HT水平的影響 見表1。與正常對照組比較，模型對照組小鼠海馬NE、DA及5-HT水平明顯均降低(P<0.05，P<0.01)。與模型對照組比較，艾司西酞普蘭組小鼠海馬5-HT，JY中劑量組小鼠海馬NE、DA及5-HT，以及JY大劑量組小鼠海馬NE水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)。結(jié)果表明PSD小鼠海馬NE等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平均明顯降低；而JY中、大劑量能明顯增加PSD小鼠海馬NE等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平，其對NE、DA及5-HT水平均有明顯上調(diào)作用。艾司西酞普蘭僅能明顯增加PSD小鼠海馬5-HT水平。

與正常對照組比較，*1P<0.05；與模型對照組比較，*2P<0.05，*3P<0.01

Compared with normal control group，*1P<0.05；compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01

表16組小鼠海馬NE、DA及5-HT水平比較

Tab.1ComparisonofNE，DAand5-HTinhippocampusamongsixgroupsofmice

組別NEDA5-HT正常對照組47.48±4.144.49±0.140.67±0.12模型對照組33.31±3.84*13.55±0.08*20.38±0.05*1艾司西酞普蘭組44.95±7.793.25±0.410.74±0.07*3JY小劑量組45.74±4.393.64±0.280.46±0.07JY中劑量組47.75±3.34*44.92±0.62*40.53±0.06*4JY大劑量組55.88±4.56*33.40±0.330.46±0.06F26.53242.25840.523

與正常對照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01；與模型對照組比較，*3P<0.01，*4P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.05，*2P<0.01；compared with model control group，*3P<0.01，*4P<0.05

2.3JY對PSD小鼠海馬5-HT1AR表達(dá)的影響 見圖3。與正常對照組比較，模型對照組小鼠海馬5-HT1AR表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與模型對照組比較，JY中、大劑量組小鼠海馬5-HT1AR表達(dá)均明顯升高(P<0.01)。結(jié)果表明PSD小鼠海馬5-HT1AR表達(dá)明顯降低；而JY中、大劑量均能夠明顯上調(diào)PSD小鼠海馬5-HT1AR表達(dá)。

與正常對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.01

Compared with normal control group，*1P<0.01；Compared with model control group，*2P<0.01

3 討論

PSD是發(fā)生于卒中之后的郁證，是在卒中基礎(chǔ)上出現(xiàn)以情緒低落、興趣減少、缺乏主動性、悲觀、失望、食欲不振等癥狀[12]。中醫(yī)學(xué)將其歸屬“郁證”與“卒中”之合病，該病病因?yàn)楦斡魵鉁?，病理基礎(chǔ)為肝腎衰弱，病理特點(diǎn)為肝腎下虛，風(fēng)痰阻絡(luò)[13]。西醫(yī)對PSD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前普遍接受包括神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制和社會心理學(xué)機(jī)制[14]?？挂钟羲幬锟梢钥焖儆行У刂委烶SD，顯著改善患者的認(rèn)知和預(yù)后，已成為治療PSD的重要手段[15]。SSRIs是PSD的治療首選藥物，但大都需2～4周才能充分顯效，且存在一定不良反應(yīng)。中醫(yī)藥近年來在治療PSD方面卓有成效，且因不良反應(yīng)少易被人們接受。

PSD動物模型目前多采用卒中伴抑郁的復(fù)合模型，經(jīng)典制備方法為結(jié)扎(或線栓)后聯(lián)合CUMS模型，符合人腦卒中后抑郁的病理特點(diǎn)[16]。因此本研究采用雙側(cè)頸總動脈線栓再灌注法制備腦缺血小鼠模型，再給予CUMS聯(lián)合制備PSD小鼠模型，其表現(xiàn)出絕望等抑郁核心癥狀。

絕望情緒是PSD患者臨床表現(xiàn)的重要癥狀[17]。強(qiáng)迫游泳和懸尾實(shí)驗(yàn)是抑郁樣行為學(xué)中評價(jià)藥物抗抑郁作用的經(jīng)典方法[18]。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)是利用動物無法逃脫水淹而誘導(dǎo)產(chǎn)生絕望行為，懸尾實(shí)驗(yàn)是利用動物無法克服不正常體位而誘導(dǎo)產(chǎn)生絕望行為，二者使動物產(chǎn)生絕望情緒的機(jī)制有一定差別[19]。本研究中，PSD小鼠在掙扎后表現(xiàn)出不動狀態(tài)，其“無助”的行為程度能夠反映其絕望狀態(tài)。因此，在懸尾實(shí)驗(yàn)中，通過對PSD小鼠不動狀態(tài)的行為學(xué)檢測，包括游泳不動時(shí)間和懸尾不動時(shí)間，評價(jià)動物的抑郁樣行為。本研究發(fā)現(xiàn)，艾司西酞普蘭及JY均能明顯減少PSD小鼠的游泳不動時(shí)間及懸尾不動時(shí)間。因此，艾司西酞普蘭及JY均能明顯逆轉(zhuǎn)PSD小鼠的絕望情緒。

PSD發(fā)病機(jī)制中經(jīng)典假說為單胺類遞質(zhì)系統(tǒng)失衡假說，即單胺類神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)功能低下，尤其是NE及5-HT等單胺類遞質(zhì)水平的低下[20-21]。海馬是參與調(diào)節(jié)情感、認(rèn)知、行為的重要中樞[22]。NE、5-HT及DA作為中樞系統(tǒng)極其重要的神經(jīng)遞質(zhì)，均可參與情感、情緒、行為、痛覺及睡眠等多項(xiàng)生理功能的調(diào)節(jié)[23]。以往研究發(fā)現(xiàn)PSD大鼠海馬組織5-HT、NE 及DA水平與正常大鼠及單純卒中大鼠比較均顯著降低[24]。5-HT1AR主要分布于與情感調(diào)節(jié)密切相關(guān)的邊緣系統(tǒng)(尤其分布于海馬神經(jīng)元和齒狀回的突觸后膜)，其功能異常與PSD的發(fā)生密切相關(guān)[22]。據(jù)報(bào)道[25]，與正常動物比較，抑郁動物模型的海馬5-HT1AR表達(dá)顯著降低，抗抑郁藥能夠通過上調(diào)抑郁動物海馬5-HT1AR表達(dá)發(fā)揮抗抑郁的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，PSD小鼠海馬5-HT1AR表達(dá)明顯降低，而JY能夠明顯上調(diào)其海馬5-HT1AR表達(dá)，表明JY發(fā)揮抗抑郁的作用應(yīng)與上調(diào)其海馬5-HT1AR表達(dá)有關(guān)。

綜上所述， JY對PSD小鼠的抑郁樣行為具有明顯的改善作用，可明顯逆轉(zhuǎn)PSD小鼠的絕望情緒，同時(shí)PSD小鼠海馬NE等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平及5-HT1AR表達(dá)明顯升高，說明JY對PSD小鼠模型具有抗抑郁的作用，其抗抑郁作用可能是通過提高海馬NE、DA及5-HT水平，以及上調(diào)海馬5-HT1AR表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。