賴紅芳，潘立衛(wèi)，黃秀香，覃光全

(河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，宜州 546300)

了哥王(WikstroemiaindicaLinn，別名Indianstringbush)屬瑞香科蕘花屬植物[1-2]，有黃皮子、南嶺蕘花、小金腰帶等別稱。其性味苦、辛微溫、毒性較大，有清熱解毒、消腫散結(jié)、逐水散瘀等功能，具有抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、抗病毒等多種藥理作用[3]。人們常用了哥王與其他中草藥配伍，用于治療坐骨神經(jīng)痛、淋巴結(jié)腫大、軟組織損傷、帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛、風(fēng)濕痛、惡性腫瘤、肝硬化等癥[4]，因主治男性病癥療效好，有利于男性，因此有了哥王之稱。目前，了哥王檢測出多種化學(xué)成分，分別是山萘酚、牛蒡苷元、南蕘酚、松脂酚、芫花素[5]、西瑞香素[6]等。其中西瑞香素為香豆素類化合物，別稱了哥王素，是了哥王藥材中主要成分，具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤[7-8]等藥理作用，也是民間藥物穿王消炎片、了哥王片等主要成分和相關(guān)藥品質(zhì)量的主要考察指標成分之一[9]。

大孔吸附樹脂不溶于酸、堿及各種有機溶劑，具有化學(xué)性質(zhì)和物理性質(zhì)穩(wěn)定性高、吸附速度快、選擇性好、比表面積大和吸附量大等優(yōu)點[10]，是一類具有很好吸附效果的有機高分子聚合物。近年來，大孔吸附樹脂在分離純化多酚、黃酮類多種活性物質(zhì)的應(yīng)用越來越普遍[11]。目前對了哥王中西瑞香素的研究主要是分離純化方法、結(jié)構(gòu)及含量測定等[12-13]，關(guān)于其分離純化工藝筆者未見報道。本實驗選用8種不同型號大孔吸附樹脂，利用靜態(tài)吸附從8種不同型號大孔吸附樹脂中篩選出一種吸附-解吸效果最好的大孔吸附樹脂，通過優(yōu)化吸附與解吸純化工藝，考察大孔吸附樹脂對了哥王中西瑞香素的純化效果的影響，為開發(fā)以西瑞香素為主的藥品及功能性食品提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(四元泵，VWD 檢測器，柱溫箱，自動進樣器)、Agilent 1260 series色譜工作站、Agilent 8453型紫外-可見分光光度計(美國安捷倫公司)；KQ250DE超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；AUW220D型天平(日本島津公司，感量：0.01 mg)；MilliporeD-Q3超純水機(美國密理博公司)。

1.2藥材與試劑 了哥王購于玉林中草藥市場，經(jīng)河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院鄧晰朝副教授鑒定為了哥王(WikstroemiaindicaLinn)根莖。西瑞香素標準品(陜西華昱生物科技有限公司，批號：51118，含量≥99.5%)；色譜純甲醇(美國Tedia公司)；大孔吸附樹脂HPD600、HPD450、D4020、AB-8、DM130、HP20、D101、NKA-9(鄭州華溢科技新材料股份有限公司)；無水乙醇及磷酸為分析純。

2 實驗方法

2.1西瑞香素的測定條件 高效液相色譜儀：色譜柱為Kramasil C18；流動相為甲醇-0.1 %磷酸溶液(55：45)；流速為0.6 mL·min-1；紫外光檢測波長為346 nm；柱溫為28 ℃；進樣量為10 μL。

2.2標準曲線的繪制 精密稱取西瑞香素標準品3 mg于小燒杯中，加入70%乙醇15 mL超聲，使之溶解，然后轉(zhuǎn)移到50 mL量瓶中，再用70%乙醇定容，搖勻，即得60 μg·mL-1的標準品儲備液。分別用移液管移取標準品儲備液，體積為0.5，1.0，3.0，5.0，7.0，9.0 mL，置于比色管中，加70%乙醇定容至10 mL，搖勻，過孔徑0.45 μm有機膜，在“2.1”項條件下測得不同濃度西瑞香素標準對照品溶液的峰面積。以西瑞香素質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

2.3了哥王中西瑞香素超聲提取 將處理好的了哥王根莖切成片，粉碎后保存，精密稱量了哥王粉末10 g置于250 mL錐形瓶中，以料液比為1：20，提取溫度為40 ℃，功率為90 W，提取溶劑為70%乙醇，超聲時間為0.4 h，超聲提取2次，合并2次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除部分溶劑，得了哥王中西瑞香素粗提液，冷藏備用。

2.48種大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸的篩選

2.4.1靜態(tài)吸附實驗 分別稱取8種大孔樹脂樹脂2.0 g于250 mL錐形瓶中，加入濃度為46.3 μg·mL-1樣品溶液25 mL，常溫，放在搖振床上振蕩24 h，轉(zhuǎn)速180 r·min-1，濾過，濾液定容至25 mL，溶液過孔徑0.45 μm有機膜濾過，用“2.2”項的條件測定濾液中西瑞香素的峰面積，代入回歸方程計算西瑞香素的質(zhì)量濃度，根據(jù)以下公式(1)計算大孔樹脂吸附率，對大孔樹脂的吸附性能進行篩選。

公式(1)：A為吸附率(%)；C0為西瑞香素的起始質(zhì)量濃度(mg ·mL-1)；V0為起始體積(mL)；C1為吸附后西瑞香素的質(zhì)量濃度(mg ·mL-1)；V1為吸附溶液體積(mL)。

2.4.2靜態(tài)解吸實驗 將充分吸附后的大孔樹脂用純化水沖洗至大孔樹脂表面無提取殘留液，然后抽干，再加入70%乙醇溶液25 mL，常溫，置于搖床上振蕩24 h，轉(zhuǎn)速180 r·min-1，充分解吸后過濾，濾液定容至25 mL，溶液過孔徑0.45 μm有機膜，用“2.2”項條件測定濾液中西瑞香素的峰面積，代入回歸方程計算西瑞香素的質(zhì)量濃度，按公式(2) 計算解吸率，對大孔樹脂解吸能力進行篩選。

公式(2)中：B為解吸率(%)；C0為西瑞香素的起始質(zhì)量濃度(mg ·mL-1)；V0為起始體積(mL)；C1為吸附后西瑞香素的質(zhì)量濃度(mg ·mL-1)；V1為吸附溶液體積(mL) ；C2為解吸液中西瑞香素的質(zhì)量濃度(mg ·mL-1)；V2為吸附溶液體積(mL)。

富集回收率=吸附率×解吸率。

2.5大孔樹脂HPD600對了哥王中西瑞香素純化工藝的吸附優(yōu)化

2.5.1上樣質(zhì)量濃度的考察 稱取5份預(yù)先處理好的大孔樹脂HPD600 3.0 g，濕法裝柱。將西瑞香素質(zhì)量濃度分別為39.3，48，61.7，86.4，144 μg·mL-1的了哥王粗提取液15 mL，以相同體積流速通過大孔樹脂樹脂柱滴下，完全吸附后，沖洗干凈，定容，溶液經(jīng)孔徑0.45 μm有機膜濾過，用“2.2”項的條件測定后計算吸附率。

2.5.2上樣體積流速的考察 稱取5份預(yù)先處理好的大孔樹脂HPD600 3.0 g，濕法裝柱。選取西瑞香素質(zhì)量濃度約90 μg·mL-1的了哥王粗提取液30 mL上柱，以不同體積流速0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL·min-1通過大孔樹脂滴下，分別收集流出液，沖洗干凈，定容，溶液經(jīng)孔徑0.45 μm有機膜濾過，用“2.2”項的條件測定后計算吸附率。

2.5.3上樣體積的考察 稱取預(yù)先處理好的大孔吸附樹脂HPD600 3.0 g，濕法裝柱，選取西瑞香素約為90 μg·mL-1的了哥王粗提取液90 mL，進行動態(tài)吸附。樣液加入流速為1.5 mL·min-1，通過大孔樹脂滴下，分段收集流出液，流速同樣為1.5 mL·min-1，每份5 mL，收集18份。溶液經(jīng)過孔徑0.45 μm有機膜，用“2.2”項條件測定后計算吸附率。

2.6大孔吸附樹脂HPD600對了哥王中西瑞香素純化工藝的解吸優(yōu)化

2.6.1洗脫劑體積分數(shù)的考察 稱取5份處理的大孔吸附樹脂HPD600 3.0 g，濕法裝柱，量取西瑞香素濃度約90 μg·mL-1樣品液45 mL，流速1.5 mL·min-1進行動態(tài)吸附，吸附完全之后，先用水10 mL沖洗，再分別以50%，60%，70%，80%，90%乙醇各30 mL進行洗脫，收集溶液，定容，溶液過孔徑0.45 μm有機膜濾過，用“2.2”項條件測定后計算解吸率。

2.6.2洗脫劑體積流速的考察 稱取5份處理好的大孔吸附樹脂HPD600 3.0 g，濕法裝柱，取西瑞香素濃度約為90 μg·mL-1的樣品液45 mL，流速為1.5 mL·min-1進行動態(tài)吸附，吸附完全之后，先用水10 mL沖洗，再用90%乙醇10 mL分別以0.5，1.5，2.5，3.5，4.5 mL·min-1流速滴下，收集溶液，定容，溶液經(jīng)孔徑0.45 μm有機膜濾過，用“2.2”項條件測定后計算解吸率。

2.6.3洗脫劑用量的考察 稱取預(yù)先處理好的大孔樹脂HPD600 3.0 g，濕法裝柱，取樣品液40 mL，含西瑞香素90 μg·mL-1，流速為1.5 mL·min-1，進行動態(tài)吸附，吸附完全后，先用水10 mL沖洗，用90%乙醇以1.5 mL·min-1流速進行解吸，每5 mL 流出液為1管收集，直到流出液接近無色時，終止收集。溶液過孔徑0.45 μm有機膜濾過，用“2.2”項條件測定后計算解吸率。

2.7驗證實驗

2.7.1驗證吸附實驗 稱取5份預(yù)先處理好的大孔樹脂HPD600 3.0 g，濕法裝柱， 按吸附單因素實驗找出的最佳實驗條件進行動態(tài)吸附，吸附完全后，先用水10 mL沖洗，收集溶液，溶液過孔徑0.45 μm有機膜濾過，用“2.2”項的條件測定后計算吸附率。

2.7.2驗證解吸實驗 采用“2.7.1”項抽干的大孔樹脂按解吸單因素找出的最佳實驗條件進行洗脫，收集其溶液，溶液過孔徑0.45 μm有機膜濾過，用“2.2”項的條件測定后計算解吸率及富集回收率。合并洗脫液，制成了哥王西瑞香素粉末，計算純度。

P(%)=C2V2/M×100 (3)

式中：P為樣品中西瑞香素的純度；C2為洗脫液中西瑞香素濃度(mg ·mL-1)；V2為洗脫液體積(mL)；M為西瑞香素樣品的質(zhì)量(干重，mg)[14]。

3 結(jié)果

3.1西瑞香素標準品和樣品高效液相色譜圖 對西瑞香素標準品的高效液相色譜圖及了哥王樣品溶液的高效液相色譜圖進行分析，西瑞香素出峰時間為4.9 min，其峰型對稱，分離效果好，結(jié)果見圖1。

A.西瑞香素標準品；B.了哥王提取液

圖1西瑞香素標準品和了哥王提取液的高效液相色譜圖

A.dephnoretin standard;B.WikstroemiaindicaLinn extraction solution

Fig.1HPLCchromatogramofdephnoretinstandardandWikstroemiaindicaLinnextractionsolution

3.2標準曲線繪制 以西瑞香素質(zhì)量濃度作為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果回歸方程為A=61.811X-74.102，R2=0.999 7，A是峰面積，X是西瑞香素質(zhì)量濃度，單位為μg·mL-1。

3.38種大孔樹脂靜態(tài)實驗的結(jié)果與分析 根據(jù)實驗結(jié)果分析，大孔樹脂HPD600的吸附率與解吸率在這些樹脂中最佳，所以選擇大孔樹脂HPD600進行下一步動態(tài)純化實驗。結(jié)果見表1。

表18種大孔樹脂對西瑞香素吸附率和解吸率

Tab.1Adsorptionrateanddesorptionrateofeightmacroporousresinsfordephnoretin

樹脂種類樹脂類型吸附率解吸率%D101非極性44.445.5HP20非極性44.946.0HPD450弱極性44.049.2NKA-9極性43.246.6HPD600極性48.750.6D4020非極性46.845.2DM130弱極性44.322.3AB-8弱極性37.344.6

3.4大孔樹脂HPD600對了哥王中西瑞香素純化工藝的吸附優(yōu)化

3.4.1上樣質(zhì)量濃度的考察 以“2.5.1”項測得西瑞香素的峰面積代入回歸方程計算西瑞香素質(zhì)量濃度，并計算該大孔樹脂的吸附率，結(jié)果吸附率分別為70.4%，79.6%，89.8%，96.3%，96.7%，見圖2。

圖2 上樣濃度對樹脂吸附效果的影響

Fig.2Impactofdifferentinitialconcentrateiononadsorptioneffectofresin

實驗結(jié)果表明，當濃度>86.4 μg·mL-1時吸附率基本沒有變化，由于濃度過高吸收雜質(zhì)過多，雜質(zhì)會覆蓋在大孔樹脂表面，會影響純化效果；濃度過低不利于吸附，吸附率低，因此上樣濃度約90 μg·mL-1，可為工業(yè)生產(chǎn)提供參考。

3.4.2上樣體積流速的考察 以“2.5.2”項測得西瑞香素的峰面積代入回歸方程式計算西瑞香素的質(zhì)量濃度，并計算相應(yīng)吸附率，結(jié)果吸附率分別為97.0%，97.2%，96.4%，95.8%，93.7%，見圖3。

圖3 不同吸附流速對樹脂吸附效果的影響

Fig.3Impactofdifferentadsorptionvelocityontheadsorptioneffectofresin

實驗結(jié)果表明，隨著上樣溶液流速逐漸增大，大孔樹脂HPD600對了哥王中西瑞香素的動態(tài)吸附率逐漸下降，由于上樣溶液的流速越小，與大孔樹脂接觸面積越大，大孔樹脂表面的吸附效果越好，流速加快，泄漏量也跟著加大，從而影響吸附效果。在上樣溶液流速分別為0.5，1.0和1.5 mL·min-1時，大孔樹脂對樣液中西瑞香素的吸附率相差不大，但過柱速率卻相差1倍，所以通過綜合考慮過柱速率與吸附率，選擇上樣樣液流速為1.5 mL·min-1。

3.4.3上樣體積的考察 以“2.5.3”項測得西瑞香素的峰面積代入回歸方程式計算每管(5 mL)西瑞香素的濃度，結(jié)果1～18號管西瑞香素的濃度分別為0.0，2.0，2.4，2.2，2.2，2.4，3.6，5.0，8.8，29.4，52.9，62.4，71.5，79.4，82.8，87.5，88.0，88.1 μg·mL-1。

實驗結(jié)果表明，當流出液收集到第9 個5 mL 的時候，西瑞香素溶液開始大量泄漏，當西瑞香素濃度約為90 μg·mL-1、樣品液為45 mL時，基本達到飽和，建議上樣液體體積為45 mL。

當了哥王中西瑞香素濃度約為90 μg·mL-1，上樣體積為45 mL，上樣流速為1.5 mL·min-1時，大孔樹脂HPD600對了哥王中西瑞香素吸附最好。

3.5大孔吸附樹脂HPD600對了哥王中西瑞香素純化工藝的解吸優(yōu)化

3.5.1洗脫劑體積分數(shù)的考察 以“2.6.1”項測得西瑞香素的峰面積代入回歸方程式計算每管西瑞香素的質(zhì)量濃度。結(jié)果解吸率分別為23.3%，50.4%，80.4%，92.9%，97.7%，見圖4。

圖4 不同濃度乙醇的洗脫效果

Fig.4Elutioneffectofdifferentconcentrationofethanol

實驗結(jié)果表明，隨著乙醇濃度逐漸增大，解吸率也隨著逐漸增大，當乙醇濃度達90%時，解吸了哥王中西瑞香素效果比較好，如果用無水乙醇進行洗脫，洗脫下來雜質(zhì)隨之增多，影響純化效果。因此選用90%乙醇對了哥王中西瑞香素進行洗脫。

3.5.2洗脫劑體積流速的考察 以 “2.6.2”項測得西瑞香素的峰面積代入回歸方程式計算西瑞香素的濃度。結(jié)果解吸率分別為57.5%，58.1%，50.3%，47.2%，39.6%，見圖5。

圖5 不同解析流速對洗脫效果的影響

Fig.5Impactofdifferentdesorptionvelocityondesorptioneffect

實驗結(jié)果表明，90%乙醇體積流速越快，解吸率越低。上樣樣液流速分別為0.5和1.5 mL·min-1時，大孔樹脂對樣液中西瑞香素的解吸率相差不大，但通過柱速率卻相差1倍，通過綜合考慮過柱速率與解吸率，因此選擇1.5 mL·min-1為洗脫劑體積流速。

3.5.3洗脫劑用量的考察 以 “2.6.3”項測得西瑞香素的峰面積代入回歸方程式計算出每管(5 mL)西瑞香素的質(zhì)量濃度，當測到濃度接近于零時，停止。1～12號管中西瑞香素的濃度分別為0.0，259.7，192.8，140.6，78.4，41.5，13.6，10.7，7.0，4.6，4.3，4.1 μg·mL-1。

實驗結(jié)果表明：當?shù)?管以后，洗脫液中西瑞香素含量很少，所以應(yīng)加90%乙醇洗脫劑體積為30 mL。

當洗脫了哥王中西瑞香素時，90%乙醇為洗脫劑，洗脫體積為30 mL，洗脫流速為1.5 mL·min-1時，對吸附后了哥王中西瑞香素的大孔樹脂HPD600解吸最好。

3.6驗證實驗 按吸附最佳條件即：西瑞香素濃度約為90 μg·mL-1，上樣體積為45 mL，上樣流速為1.5 mL·min-1時重復(fù)實驗5次，以“2.7.1”項測得西瑞香素的峰面積代入回歸方程式計算西瑞香素的質(zhì)量濃度，并計算大孔樹脂HPD600的吸附率，結(jié)果吸附率分別為97.7%，96.2%，97.0%，97.2%，97.0%；按解吸最佳條件即：90%乙醇為洗脫劑，洗脫體積為30 mL，洗脫流速為1.5 mL·min-1進行洗脫，以“2.7.2”項測得西瑞香素的峰面積代入回歸方程式計算出西瑞香素的質(zhì)量濃度，并計算大孔樹脂HPD600的解吸率，結(jié)果解吸率為98.0%，91.7%，98.1%，97.3%，97.3%，富集西瑞香素回收率為95.7%，88.2%，95.1%，94.5%，94.3%。純化后西瑞香素純度由29%提高到53%。

4 討論

通過實驗可知，大孔樹脂HPD600對了哥王中西瑞香素具有良好的吸附和解吸性能，了哥王樣品原液中的西瑞香素大部分被樹脂吸附，而且解吸的效果也很好。說明大孔吸附樹脂HPD600是分離純化了哥王中西瑞香素的優(yōu)良材料。

本實驗結(jié)果表明，HPD600純化了哥王中西瑞香素較佳吸附條件為上樣濃度約為90 μg ·mL-1，上樣液體體積為45 mL，上樣速度為1.5 mL·min-1，吸附率達97.5%；較佳的洗脫條件為乙醇濃度90%，洗脫劑體積為30 mL，洗脫速度1.5 mL·min-1，解吸率為96.4%，富集西瑞香素回收率93.6%，西瑞香素含量明顯升高，說明該純化工藝效果良好。該實驗結(jié)果為了哥王中西瑞香素的工業(yè)化純化提供了理論參考。