吳堃，李光，李宜航，呂亞娜，肖建琴，孫慧峰

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱 150040；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所，景洪 666100；3.西雙版納傣藥南藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，景洪 666100；4.云南中醫(yī)學(xué)院，昆明 650500)

劍葉龍血樹[Dracaenacochinchinensis(Lour) S.C.Chen]含樹脂木材是國產(chǎn)血竭的主要生產(chǎn)原料。國產(chǎn)血竭又稱龍血竭，是傷科要藥，具有活血化瘀、止血、鎮(zhèn)痛、解痙、抗炎及降糖作用[1]。藥理研究表明龍血竭具有抗炎鎮(zhèn)痛、保護(hù)心肌細(xì)胞、抗血小板聚集等作用，被譽(yù)為“活血之圣藥”[2-4]。由于龍血竭療效明確，臨床用量不斷增加，而且國內(nèi)劍葉龍血樹瀕臨滅絕[5]，提高劍葉龍血樹資源利用度成為目前保護(hù)其資源的重要手段之一。

缺氧復(fù)氧處理H9c2心肌細(xì)胞模型是目前研究心肌缺血-再灌注損傷(myocardial ischemia / reperfusion injury，MIRI)最常見的體外模型[6-7]，目前MIRI已成為臨床上影響冠心病患者獲得再灌注最佳療效的主要障礙，臨床上尚無有效藥物進(jìn)行干預(yù)[8]。龍血竭中黃酮類成分能夠改善心肌缺血大鼠的心臟功能[9]，并且對(duì)動(dòng)脈血栓的形成具有明顯的抑制作用[10]。筆者尚未見關(guān)于從劍葉龍血樹含脂木材中提取得到總黃酮類成分的藥效學(xué)報(bào)道。通過研究劍葉龍血樹黃酮的藥效，對(duì)深入開發(fā)劍葉龍血樹資源，提高其利用度具有重要意義。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 大鼠H9c2心肌細(xì)胞株，為大鼠胚胎心肌層細(xì)胞(Procell公司，貨號(hào)：CL-0089)；劍葉龍血樹含脂木材(西雙版納柬龍制藥有限公司，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所李學(xué)蘭研究員鑒定)；龍血素B對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111558-201407)，二甲亞砜(DMSO)(VWR公司，批號(hào)：0666C081)；胰蛋白酶(Gibco公司，批號(hào)：1869505)；脫脂奶粉(BD公司，批號(hào)：1785989)；胎牛血清(Procell公司，批號(hào)：20151206)；達(dá)爾伯克改良伊格爾(DMEM)高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司，批號(hào)：AB217802)；DMEM無糖培養(yǎng)基(Gibco公司，批號(hào)：1810192)；電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(批號(hào)：0181508)、二辛可酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒(批號(hào)：00171509)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白抽提試劑盒(批號(hào)：00041503)、轉(zhuǎn)膜液(批號(hào)：00151511)、聚丙烯酰胺凝膠電泳液(批號(hào)：202010)、TBST緩沖液(批號(hào)：40147)均購自康為世紀(jì)公司；PI3K抗體(批號(hào)：2592322)、Akt抗體(批號(hào)：2626023)、Caspase-3抗體(批號(hào)：2631150)、Bcl-2(批號(hào)：2436331)均購自Millipore公司；Bax抗體(Abcam公司，批號(hào)：GR187478-10)； Caspase-8抗體(Abcam公司，批號(hào)：GR227627-3)；細(xì)胞凋亡流式試劑盒(Thermo公司，批號(hào)：V13242)；CCK-8(江蘇碧云天公司，C0038)。

1.2儀器與設(shè)備 ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色譜儀，PDA eλ檢測器(Waters公司)；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；XK96-8旋轉(zhuǎn)振蕩器(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司)；Spectramax i3酶標(biāo)儀[美谷分子儀器(上海)有限公司]；VE-180B電泳槽(上海天能科技有限公司)；Tanon 5200 Multi凝膠成像儀(上海天能科技有限公司)；SiGmA3K15，SiGmA1-14離心機(jī)(德國西格瑪sigma公司)；NU-4950三氣培養(yǎng)箱(美國Nuaire公司)；HF160W二氧化碳培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)技術(shù)有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1劍葉龍血樹總黃酮(Dracaenacochinchinensisflavonoids，DCF)提取和精制 將劍葉龍血樹含脂木材粉碎后，粉碎過孔徑0.180 mm(80目)篩，參照文獻(xiàn)[11]方法提取總黃酮。以龍血素B為對(duì)照品，使用分光光度法[11]測定精制后提取物黃酮含量為(54.30±2.38)%。

參考文獻(xiàn)[12]介紹的方法，采用超高液相色譜法對(duì)DCF進(jìn)行分析，色譜柱：ACQUTY UPLC C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)梯度洗脫，線性洗脫程序?yàn)?～3 min，10%→18% A，3～15 min，18%→60% A，15～20 min，60%→90% A；流速0.3 mL·min-1；檢測波長210 nm；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量3 μL。共得到28個(gè)色譜峰，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，其中1，3，13，14，24號(hào)峰分別為白藜蘆醇、7，4’-二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B、紫檀芪。見圖1。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng) H9c2細(xì)胞用含10%胎牛血清，1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d 更換培養(yǎng)液，4 d 傳代一次。

1.3.3CCK-8法測定DCF對(duì)H9c2心肌細(xì)胞毒性作用和H9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型的干預(yù)作用 H9c2心肌細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化收集，按每孔8000 個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24 h后，加入DCF，使其終濃度為100，50，25，12.5，6.25，3.125 μg·mL-1，每種濃度3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，取出96孔板吸出含藥培養(yǎng)基每孔加CCK-8溶液10 μL，DMEM培養(yǎng)基90 μL，置于37 ℃孵育4 h后，測定波長450 nm處的吸光度。

H9c2心肌細(xì)胞以2.5×104·mL-1接種到96孔板中，每孔200 μL。培養(yǎng)24 h后，對(duì)H9c2心肌細(xì)胞進(jìn)行如下分組：正常對(duì)照組和模型對(duì)照組，加入DMEM培養(yǎng)基；DCF大、中、小劑量組(20， 10， 5 μg·mL-1)，每組6個(gè)復(fù)孔，給藥預(yù)處理24 h。吸出含藥培養(yǎng)基更換為無血清無糖DMEM培養(yǎng)基，缺氧4 h后，進(jìn)行復(fù)氧處理，復(fù)氧16 h，CCK-8法檢測細(xì)胞存活率。

A.劍葉龍血樹提取物；B.白藜蘆醇對(duì)照品；C.7,4'-二羥基黃酮對(duì)照組；D.龍血素A對(duì)照品；E.龍血素B對(duì)照品；F.紫檀芪對(duì)照品；1.白藜蘆醇；3.7,4'-二羥基黃酮；13.龍血素A；14.龍血素B；24.紫檀芪

圖16種溶液的HPLC圖

A.Dracaenacochinchinensis(Lour) S.C. Chen extract；B.reference substance of resveratrol；C.reference substance of 7,4'-dihydroxy flavonoids；D.reference substance of loureirin A；E.reference substance of loureirin B；F.reference substance of pterostilbene；1.resveratrol；3.7,4'-dihydroxy flavonoids；13.loureirin A；14.loureirin B；24.pterostilbene

Fig.1HPLCchromatogramofsixkindsofsolution

1.3.4流式細(xì)胞儀檢測DCF對(duì)H9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型的干預(yù)作用 H9c2心肌細(xì)胞以10×104·mL-1接種到6 mm培養(yǎng)皿中，每孔接種800 μL，按照“1.3.3”項(xiàng)中進(jìn)行藥物預(yù)處理并建立缺氧復(fù)氧損傷模型。用胰酶消化細(xì)胞，300×g離心10 min后，棄去上清液，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，離心去上清液，加1×Annexin-binding Buffer 100 μL 重懸細(xì)胞，并加入Annexin V 5 μL和PI工作液1 μL室溫避光孵育20 min，再加入 Annexin-binding Buffer400 μL混勻，置冰盒內(nèi)保存，于流式細(xì)胞儀中檢測。

1.3.5Western blotting法測定DCF對(duì)缺氧復(fù)氧模型H9c2心肌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響 經(jīng)過藥物預(yù)處理的缺氧復(fù)氧H9c2細(xì)胞使用胰酶消化收集后，4 ℃預(yù)冷PBS清洗2次，加細(xì)胞裂解液99 μL和蛋白酶抑制劑1 μL混合液，冰浴上反應(yīng)20 min，18 000×g離心15 min，取上清液使用BCA法定量后，按1：4加Loading Buffer混勻沸水浴5 min后于-80 ℃凍存待測。

蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，濕轉(zhuǎn)法至硝酸纖維素膜上，再置封閉液中室溫振搖2 h，分別加入鼠多克隆抗體Akt、β-actin、caspase-3和Bcl-2、Bax、PI3k、caspase-8抗體于4 ℃孵育過夜，TBST漂洗10 min×3次，二抗為用HRP標(biāo)記的羊抗鼠、羊抗兔 IgG 抗體(1：5000)， 室溫振搖孵育1 h，漂洗后用ECL顯色，室溫孵育3 min，曝光攝像，并計(jì)算灰度值。

2 結(jié)果

2.1DCF對(duì)H9c2心肌細(xì)胞毒性作用及缺氧復(fù)氧模型的保護(hù)作用 加入DCF 24 h后，利用CCK-8法測定細(xì)胞存活率，結(jié)果100，50，25，12.5，6.25，3.125 μg·mL-1DCF組H9c2細(xì)胞相對(duì)存活率分別為(26.02±2.21)%，(85.78±13.88)%，(92.25±9.99)%，(94.62±4.54)%，(104.20±4.94)%，(99.46±10.70)%;正常對(duì)照組H9c2細(xì)胞存活率(100.00±6.99)%。100 μg·mL-1DCF對(duì)H9c2細(xì)胞表現(xiàn)出一定的毒性作用，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=10.66，P<0.01)，IC50擬合結(jié)果為77.05 μg·mL-1(R2=0.9121)。

進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理后，20，10，5 μg·mL-1DCF組 H9c2細(xì)胞的相對(duì)存活率分別為(35.10±1.52)%，(44.70±2.27)%，(51.09±3.61)%，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組 H9c2細(xì)胞存活率分別為(100.00±6.40)%，(33.41±1.24)%。模型對(duì)照組細(xì)胞存活率明顯低于正常對(duì)照組(q=32.50，P<0.01)，10，5 μg·mL-1DCF可以增加缺氧復(fù)氧模型心肌細(xì)胞的存活率，與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=5.506，8.626，P<0.01)。

2.2流式細(xì)胞術(shù)測定各組細(xì)胞凋亡 給藥預(yù)處理24 h，更換無血清無糖培養(yǎng)基缺氧4 h復(fù)氧16 h處理，按照說明書方法進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，結(jié)果見圖2。

缺氧復(fù)氧處理后模型對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(42.4±1.68)%，DCF中、小劑量組細(xì)胞凋亡率分別為(34.1±1.98)%，(29.4±2.63)%，并且中晚凋亡象限下細(xì)胞數(shù)也有明顯減少，因此可推斷其作用機(jī)制可能是抑制早凋亡及晚凋亡因子的生成。

2.3Western blotting測定凋亡蛋白表達(dá) 給藥后進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理，處理結(jié)束后提取蛋白，進(jìn)行Western blotting測定，結(jié)果見表1。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.DCF大劑量組；D.DCF中劑量組；E.DCF小劑量組；與模型對(duì)照組比較，*1P<0.01

A.normal control group；B.model control group；C.high-dose DCF group；D.medium-dose DCF group；E.low- dose DCF group；compared with model control group,*1P<0.01

Fig.2EffectofDCFonapoptosisofH9c2cardiacmyocytes

表15組H9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧處理后的凋亡蛋白表達(dá)

組別caspase-8/β-actincaspase-3/β-actinBcl-2/β-actinBax/β-actinAkt/β-actinPI3k/β-actin正常對(duì)照組1.156±0.198*10.691±0.078*11.134±0.150*21.185±0.210*20.519±0.0670.749±0.084*2模型對(duì)照組2.104±0.1701.098±0.1100.600±0.0632.473±0.3100.338±0.0490.350±0.042DCF 大劑量組2.292±0.3471.496±0.241*11.379±0.170*21.460±0.200*20.244±0.0370.871±0.096*2 中劑量組1.823±0.1600.603±0.079*10.631±0.0730.676±0.073*20.941±0.097*21.123±0.142*2 小劑量組1.579±0.140*21.460±0.2160.631±0.0691.058±0.190*22.092±0.240*21.429±0.162*2

與模型對(duì)照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01

Compared with model control group，*1P<0.05，*2P<0.01

通過缺氧復(fù)氧處理后，模型對(duì)照組與正常組比較，蛋白表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而給予DCF后，DCF中劑量組及小劑量組能夠顯著上調(diào)PI3K及Akt蛋白表達(dá)，DCF大、中、小劑量組能夠顯著下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，DCF大劑量組能夠顯著上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，而DCF中劑量只能顯著下調(diào)Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)，DCF小劑量組能夠顯著下調(diào)Cleaved Caspase-8蛋白表達(dá)。

3 討論

H9c2心肌細(xì)胞是20世紀(jì)70年代由KIMES等[13]從胚胎期BDIX大鼠心臟組織中分離得到的一種具有骨骼肌特性的心肌細(xì)胞株，與原代心肌細(xì)胞相比具有可分裂、傳代培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，是體外研究心血管疾病藥效及作用靶點(diǎn)的最主要材料。本研究利用缺氧復(fù)氧處理H9c2心肌細(xì)胞模擬心肌缺血-再灌注損傷模型，能夠較為真實(shí)反映DCF的作用機(jī)制。

本研究中劍葉龍血樹黃酮類成分提取率較高，比對(duì)文獻(xiàn)[14]，龍血竭中主要成分如龍血素A、龍血素B、白藜蘆醇、紫檀芪等均在劍葉龍血樹黃酮中得到，且劍葉龍血樹黃酮含量要高于龍血竭藥材中總黃酮含量，這也為劍葉龍血樹黃酮的產(chǎn)品開發(fā)及深入研究其作用機(jī)制提供了依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，DCF中、小劑量組對(duì)缺氧復(fù)氧處理H9c2心肌細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過上調(diào)PI3K、Akt蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-8等蛋白的表達(dá)相關(guān)，這可能與白藜蘆醇、紫檀芪等成分植物雌激素樣作用相關(guān)[15-16]。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DCF與凋亡蛋白的表達(dá)并不存在嚴(yán)格的劑量依賴關(guān)系，中劑量組降低Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)更為明顯，小劑量組下調(diào)Cleaved Caspase-8蛋白表達(dá)更為明顯，而大劑量組能夠顯著上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，這可能是由DCF中不同化合物活性差異引起，有待進(jìn)一步驗(yàn)證，DCF成分與作用機(jī)制間的關(guān)系將是后期研究的重點(diǎn)。