侯廣玉，李孟全，趙鵬程，王一成，朱立雙，杜書迪

(黑龍江省腫瘤疾病防治重點實驗室、牡丹江醫(yī)學院，牡丹江 157011)

惡性腫瘤是威脅人類健康的重大疑難疾病，根據(jù)國家癌癥中心報道，全球惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢[1]。惡性腫瘤的常規(guī)醫(yī)治方法，諸如手術、放射治療、化學治療、生物治療等，雖然可以最大限度地減瘤負荷，但是副作用較大，容易復發(fā)轉移[2]。中藥抗腫瘤具有多靶點、多效應、不良反應小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢[3]?？葼柨殿w粒為中藥制劑，其組方是在古方二陳湯基礎之上加味衍化而成，主要藥味包括半夏、黃芩、茯苓、甘草、陳皮等。本課題組前期研究結果顯示該方劑不僅具有止咳、祛痰、平喘和抗炎作用，同時具有抗菌、抗病毒、提高機體免疫力之功效[4-8]。近年文獻報道其中主要藥味具有抗腫瘤活性[9-13]，提示該方劑有望開發(fā)成特色有效的抗腫瘤中藥。本研究制備咳爾康顆粒，參照《中華人民共和國藥典》(2015年版)建立其高效液相色譜法(HPLC)質量控制標準[14]以監(jiān)控質量；觀察咳爾康顆粒對腫瘤細胞A549細胞形態(tài)、細胞核形態(tài)、細胞增殖與凋亡以及相關基因mRNA表達的影響，為開發(fā)抗腫瘤中藥資源提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1細胞株 人肺腺癌細胞株A549購于中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。

1.2藥物 中藥飲片：茯苓(安徽岳西，批號：14040006)、清水半夏(甘肅清水，批號：13110016)、甘草(內(nèi)蒙古杭錦旗，批號：14040024)、紫菀(河北安國，批號：13090051)、黃芩(河北燕山，批號：13090030)、陳皮(福建泉州，批號：13030009)，以上中藥飲片購自安國市同義中藥飲片有限公司；糊精、淀粉(安徽山河藥用輔料股份有限公司)；黃芩苷(上海源葉生物科技有限公司，批號：PS0912SB13)。

1.3試劑 高糖達爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基(HyClone公司，批號：AAM09207)；胎牛血清(Bioclot lot，No.1964)；噻唑藍(MTT，Sigma公司，MKBB1495)；DAPI染色液(Sigma公司，批號：D9542)；RNA提取試劑盒( OMEGA R6812)、逆轉錄試劑盒(Roche 04897030001)、SYBR Green(Roche 04913914001)、甲醇(色譜純，天津市永大化學試劑有限公司，批號：20130716)，無水乙醇和磷酸均為分析純，購自哈爾濱市龍盛精科化學試劑有限公司。

1.4儀器 高效液相色譜儀(LC-10A，日本島津公司)；二氧化碳(CO2)恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Forma 371型)；倒置相差顯微鏡(Leica DM IL LED)；多功能讀板機(SpectraMax?M3)；熒光倒置顯微鏡(Olympus IX73)；酶聯(lián)免疫鏈式反應(PCR)分析儀(MycyclerTMThermal cycler 580BR11617，BIO-RAD，U.S.A.)；實時定量PCR分析儀(StepOneTMReal-Time PCR System 271000894，ABI，Singapore)。

1.5實驗方法

1.5.1咳爾康顆粒的制備及其質量控制 處方藥材速洗、水煎、濃縮，加入輔料淀粉糊精混合制備咳爾康顆粒，依法[14]建立咳爾康顆粒HPLC質量控制標準。根據(jù)其中已知成分黃芩苷對人肺腺癌A549 細胞具有抑制作用[10]，所以選用黃芩苷作為咳爾康顆粒含量控制指標。采用Hypersil ODS2色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-0.4% 磷酸(50：50)洗脫，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長278 nm。以流動相制備顆粒劑供試溶液和黃芩苷標準溶液，經(jīng)孔徑0.45 μm濾膜濾過，進樣量20 μL。色譜行為見圖1，以峰面積對濃度進行線性回歸，得回歸方程Y=63 065X-14 594(r=0.992 9，n=6)，平均加樣回收率98.03%，RSD=2.571%(n=5)。采用此方法測得咳爾康顆粒中黃芩苷含量0.349 8‰。

A.供試溶液； B.標準溶液； C.流動相

Fig.1HPLCchromatogramofthreekindsofsolution

1.5.2含藥血清培養(yǎng)液的制備 精密稱取咳爾康顆粒1.325 g，加10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液10.00 mL，磁力攪拌30 min，經(jīng)孔徑0.22 μm濾膜濾過除菌，即得濃度為132.5 g·L-1咳爾康顆粒儲備液，保存于-70 ℃?zhèn)溆?，臨用時加10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液稀釋成系列工作濃度。根據(jù)黃芩苷對人肺腺癌A549 細胞具有抑制作用[10]，所以選用黃芩苷作為陽性對照藥物。精密稱取黃芩苷對照品1.445 mg，加10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液10.00 mL，磁力攪拌30 min，經(jīng)孔徑0.22 μm濾膜濾過除菌，即得濃度為0.1445 g·L-1黃芩苷對照品工作液，保存于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3細胞培養(yǎng)及傳代 腫瘤細胞A549接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)時每瓶加入培養(yǎng)液(培養(yǎng)液配制：10%胎牛血清+1%雙抗+89%DMEM高糖培養(yǎng)基)4～5 mL。培養(yǎng)箱環(huán)境設定為37 ℃、CO2含量為5%。新種植的細胞在培養(yǎng)箱中孵育2～3 d，當瓶底細胞密度達到80%，進行細胞傳代。吸棄舊液，PBS輕柔洗滌2次，以0.25%胰酶消化至圓形，依據(jù)細胞量進行1：2或者1：3傳代，再放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5.4MTT法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期A549腫瘤細胞調整密度為4×105·mL-1，接種在96孔板內(nèi)，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。咳爾康組換上不同濃度的咳爾康顆粒血清培養(yǎng)液，黃芩苷組換上0.1445 g·L-1黃芩苷血清培養(yǎng)液，正常對照組加入相同體積的血清培養(yǎng)液，每組設7個平行孔，培養(yǎng)36 h。棄去上清液，每孔加入新鮮配制0.5 g·L-1MTT的培養(yǎng)液200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，酶標儀570 nm測定每孔的吸光度值(A)。抑瘤率(%)=(1-A藥物組/A正常對照組)×100%。

按照鐘昕[8]方法測定裂褶多糖的重均分子量(Mw)、數(shù)均分子量(Mn)和分散系數(shù)(Mw/Mn)。采用Astra軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.5.5細胞形態(tài)觀察及4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色后細胞核形態(tài)觀察 取對數(shù)生長期A549腫瘤細胞調整密度為4×105·mL-1，接種在含有蓋玻片的6孔板內(nèi)，每孔1 mL，置于培養(yǎng)箱中。約6 h細胞貼壁后，咳爾康組分別換上高、中、低濃度(通過MTT實驗確定)的咳爾康顆粒血清培養(yǎng)液，黃芩苷組換上0.1445 g·L-1黃芩苷血清培養(yǎng)液，正常對照組加入相同體積的血清培養(yǎng)液，每組設3個平行孔，培養(yǎng)36 h，光鏡下觀察細胞形態(tài)變化。吸出培養(yǎng)液，4%甲醛固定1 h；PBS洗3次。取出蓋玻片置于玻璃平皿中，二甲苯洗5 min，100%→0%乙醇梯度洗脫，梯度為10%。每孔加入2 mg·L-1DAPI染色液，避光染色10 min，去除染色液，雙蒸水洗3次，樹膠封片，熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)。

1.5.6實時定量PCR檢測基因表達 將4×105·mL-1A549腫瘤細胞接種在6孔板中，每孔3 mL，置于孵箱中。約6 h細胞貼壁后，咳爾康組分別換上高、中、低濃度(通過MTT實驗確定)的咳爾康顆粒血清培養(yǎng)液，黃芩苷組換上0.1445 g·L-1黃芩苷血清培養(yǎng)液，正常對照組加入相同體積的血清培養(yǎng)液，每組設3個平行孔，培養(yǎng)36 h。提取總RNA、逆轉錄為cDNA(按說明書操作)，用實時定量PCR系統(tǒng)檢測基因c-myc、c-fos、bax、bcl-2 和caspase-9 mRNA表達，引物序列見表1。

表1實時定量PCR分析的基因引物序列

Tab.1Primersequenceofreal-timequantitativePCR

基因引物名稱引物序列(5' → 3')擴增片段長度/bp退火溫度/℃c-mycFGGCTCCTGGCAAAAGGTCA11962.2RCTGCGTAGTTGTGCTGATGT60.4c-fosFGGGGCAAGGTGGAACAGTTAT12662.1RCCGCTTGGAGTGTATCAGTCA61.5blc-2FGGTGGGGTCATGTGTGTGG8962.6RCGGTTCAGGTACTCAGTCATC61.8baxFCCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG15562.1RCCAGCCCATGATGGTTCTGAT61.9caspase-9FCTCAGACCAGAGATTCG-CAAAC11660.9RGCATTTCCCCTCAAACTCT-CAA60.5GAPDHFAGAAGGCTGGGGCTCATTTGRAGGGGCCATCCACAGTCTTC

實時定量PCR擴增反應的條件為95 ℃預變性5 min 1個循環(huán)后，每個循環(huán)變性95 ℃、30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45個循環(huán)，采集循環(huán)退火后的熒光信號，結果分析時以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCT法檢測mRNA的相對表達量。

2 結果

2.1咳爾康顆粒劑對A549腫瘤細胞增殖的影響 采用MTT法檢測細胞增殖，結果見表2。與正常對照組比較，黃芩苷組的A值顯著降低，抑瘤率14.00%；咳爾康組隨著咳爾康顆粒劑濃度的增加其A值逐漸降低，呈現(xiàn)出劑量依賴性抑制腫瘤細胞增值作用(F=83.40，P<0.01)。根據(jù)抑瘤率的量效關系求算半效抑瘤濃度(IC50)為74.07 g·L-1。

表27組細胞增殖情況比較

組別藥物濃度/(g·L-1)A(n=7)抑瘤率/%正常對照組——2.916±0.038—黃芩苷組黃芩苷0.144 52.508±0.157*114.00咳爾康1組咳爾康顆粒0.132 52.814±0.0642.59咳爾康2組咳爾康顆粒1.3252.841±0.0843.51咳爾康3組咳爾康顆粒2.5602.577±0.167*211.64咳爾康4組咳爾康顆粒13.252.571±0.069*111.84咳爾康5組咳爾康顆粒132.50.417±0.061*185.71

與正常對照組比較，*1P<0.01，*2P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.01，*2P<0.05

2.2咳爾康顆粒劑對A549細胞形態(tài)及細胞核形態(tài)的影響 采用光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)，采用熒光顯微鏡觀察DAPI染色細胞核形態(tài)，結果見圖2。正常對照組的細胞形態(tài)完整，生長良好。咳爾康組隨著咳爾康顆粒濃度的增加出現(xiàn)體積縮小，與周圍的細胞脫離，細胞數(shù)量逐漸減少，生長狀況越來越差，并出現(xiàn)懸浮細胞；DAPI染色后，正常對照組的細胞核比較規(guī)則，近乎圓形，染色質均勻，核膜完整?？葼柨到M隨著咳爾康顆粒濃度的增加逐漸出現(xiàn)核質濃縮，顆粒物質出現(xiàn)，熒光強度增大，核質外溢，核膜破碎，最終形成凋亡小體。

2.3咳爾康顆粒對A549腫瘤細胞基因表達的影響 采用實時定量PCR比較CT值(2-ΔΔCT法)檢測A549腫瘤細胞中原癌基因和凋亡基因mRNA的表達，結果見圖3。與正常對照組比較，隨著咳爾康顆粒濃度的增加，咳爾康組原癌基因c-myc和c-fos的mRNA表達量呈現(xiàn)劑量依賴性降低；凋亡基因bax/bcl-2比值和caspase-9的mRNA表達量呈現(xiàn)劑量依賴性升高。

A.正常對照組；B.低濃度咳爾康組(1.325 g·L-1)；C.中濃度咳爾康組(2.560 g·L-1)；D.高濃度咳爾康組(13.25 g·L-1)；E.黃芩苷組(0.1445 g·L-1)

圖25組A549腫瘤細胞的細胞形態(tài)與細胞核形態(tài)

A.normal control group；B.low-doseKeerkanggroup(1.325 g·L-1)；C.medium-doseKeerkanggroup(2.560 g·L-1)；D.high-doseKeerkanggroup(13.25 g·L-1)；E.baicalin group(0.1445 g·L-1)

Fig.2MorphologyofcellsandnucleusinfivegroupsofA549tumorcells

A.正常對照組；B.低濃度咳爾康組(1.325 g·L-1)；C.中濃度咳爾康組(2.560 g·L-1)；D.高濃度咳爾康組(13.25 g·L-1)；E.黃芩苷組(0.1445 g·L-1)；與正常對照組比較，*1P<0.01，*2P<0.05

A.normal control group；B.low-doseKeerkanggroup(1.325 g·L-1)；C.medium-doseKeerkanggroup(2.560 g·L-1)；D.high-doseKeerkanggroup(13.25 g·L-1)；E.baicalin group(0.1445 g·L-1)；Compared with normal control group,*1P<0.01，*2P<0.05

3 討論

中醫(yī)學認為痰濕體質與腫瘤具有高度相關性[15]。中醫(yī)講的痰濕亦稱之為痰，即廣義的痰，是人體內(nèi)的水液津液凝結而成的黏稠物或者塊狀物?！兜は姆ā吩唬骸胺踩松砩稀⒅?、下有塊者多是痰”。中醫(yī)講怪病多痰，就是說凡是治不好的怪病大多是體內(nèi)有痰。痰濕會影響到氣血運行、物質代謝、細胞正常生長以至于生成腫瘤。中醫(yī)古方“二陳湯”由法半夏、陳皮、茯苓、甘草組成。其中半夏燥濕化痰、降逆和胃，為君藥；陳皮燥濕祛痰并善理氣健脾，其與半夏相配共祛濕痰、調暢氣機、使胃氣得和，為臣藥；茯苓健脾滲濕，其與陳皮相伍則脾濕得化、脾氣得暢而助君藥祛痰之功，為佐藥；甘草既助茯苓健脾和中，又調和諸藥而兼潤肺，為使藥。整方具有燥濕化痰、理氣和中之功效。近年報道以二陳湯為基礎隨證加減有助于治療惡性腫瘤[16-17]。本研究在二陳湯基礎之上加味衍化，制得咳爾康顆粒劑。參照《中華人民共和國藥典》(2015年版)指導原則建立該制劑的HPLC質量控制標準，為進一步可重復地研究提供前提保障。

按咳爾康顆粒劑中黃芩苷的含量為0.3498‰計算，高濃度咳爾康(132.5 g·L-1)中黃芩苷的含量是0.046 g·L-1，顯著低于黃芩苷組黃芩苷的濃度(0.1445 g·L-1)，所以咳爾康顆粒劑對肺腺癌細胞A549體外抗腫瘤作用并非一定是黃芩苷的作用，實際上可能是其多種成分共同作用的結果[9-13]。

黃芩苷組主要有兩方面作用：一方面說明實驗的有效性，假如陽性對照無效，說明該實驗存在問題；另一方面是比較受試藥物與陽性藥物的藥效，評價受試藥物藥效的優(yōu)劣。本研究以黃芩苷為陽性對照，主要是用于說明實驗的有效性。之所以沒用黃芩苷評價咳爾康顆粒藥效的優(yōu)劣，是因為咳爾康顆粒的藥效并非一定是黃芩苷的作用，可能是多種成分共同作用的結果，加之本研究內(nèi)容主要是機制方面，因此與黃芩苷作用的比較難以評價咳爾康療效的優(yōu)劣。

本研究結果顯示，與正常對照組比較，咳爾康顆粒具有劑量依賴性抑制A549腫瘤細胞增殖作用，即隨著藥物濃度的升高其抑制率增大。

細胞形態(tài)和數(shù)量的變化是藥物體外抗腫瘤活性最直觀指標。本研究在光學顯微鏡下觀察到咳爾康顆粒劑影響腫瘤細胞的形態(tài)和數(shù)量。DAPI 為一種熒光染料，可以穿透細胞膜與細胞核中的雙鏈DNA結合而發(fā)揮標記的作用，產(chǎn)生比DAPI自身強20多倍的熒光，在熒光顯微鏡下可以看到細胞核的形態(tài)變化。DAPI染色常用于細胞凋亡檢測。本研究DAPI染色結果表明咳爾康顆粒劑可誘導腫瘤細胞凋亡。

原癌基因c-myc和c-fos編碼的核轉錄因子與啟動子和增強子序列結合，促進生長促進基因的轉錄，從而促進細胞增殖。這類基因在腫瘤細胞中過度表達。本研究實時定量PCR顯示，咳爾康顆粒劑可抑制腫瘤細胞原癌基因c-myc和c-fos的mRNA表達，推測此作用與其抑制腫瘤細胞增殖的機制相關聯(lián)。促凋亡基因bax 表達產(chǎn)物Bax蛋白能自身形成同源二聚體Bax/Bax，提高線粒體通透性，使細胞色素C釋放出來，促進細胞凋亡。抗凋亡基因bal-2表達產(chǎn)物bal-2蛋白能與bax形成異源二聚體bal-2/bax，從而抑制bax發(fā)揮作用。因此bax/bal-2或bal-2/bax比例是決定細胞進入凋亡與否的關鍵因素。凋亡基因caspase-9表達產(chǎn)物caspase-9蛋白為線粒體/細胞色素C介導的凋亡通路中重要成員，可激活其下游蛋白caspase-3，導致細胞凋亡。本研究實時定量PCR顯示，咳爾康顆粒劑可提高bax/bcl-2的mRNA表達比例，提高caspase-9的mRNA表達，推測此作用與其促進腫瘤細胞凋亡的機制相關聯(lián)。

(志謝：本研究的實驗過程得到牡丹江醫(yī)學院趙冰海博士、李洪志老師以及牡丹江醫(yī)學院大學生科研創(chuàng)新團隊肖圓圓和于夢書同學的鼎力相助，在此一并表示誠摯謝意。)