徐艷梅，裴麗娟，杜高鋒，宋更申

(1.河北省藥品檢驗(yàn)研究院，石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科， 石家莊 050031)

依度沙班(edoxyaban)是一種新型Xa因子抑制藥[1-2]，具有起效快、抗凝效果可逆、具有劑量依賴的效果等特點(diǎn)。2015年以來，美國食品藥品管理局(FDA)、歐洲藥品管理局(EMA)和瑞士藥品管理局相繼批準(zhǔn)依度沙班用于非瓣膜性心房顫動(dòng)患者腦卒中及系統(tǒng)性栓塞、急性靜脈栓塞患者深靜脈血栓和肺栓塞的預(yù)防及治療[3]。依度沙班原料藥在合成工藝中有一步甲磺?；倪^程，其中甲磺酰氯易與醇類反應(yīng)產(chǎn)生甲磺酸酯[4]。依度沙班合成工藝中將甲醇和乙醇作為反應(yīng)溶劑，因此依度沙班原料藥中可能存在甲磺酸甲酯(methyl methanesulfonate)、甲磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate)及甲磺酸異丙酯(isopropylmethanesulfonate)3種雜質(zhì)。甲磺酸酯類物質(zhì)是一種潛在性基因毒性雜質(zhì)[5-6]，這些雜質(zhì)的DNA烷基化作用會(huì)產(chǎn)生誘變效應(yīng)、致癌效應(yīng)和致畸效應(yīng)[7]，嚴(yán)重威脅人類健康，因此需要嚴(yán)格控制藥品中甲磺酸酯的限度。根據(jù)EMEA發(fā)布的《遺傳毒性雜質(zhì)限度指導(dǎo)原則》相關(guān)規(guī)定，按照毒理學(xué)擔(dān)憂閾值(TTC)作為評(píng)價(jià)大部分遺傳毒性雜質(zhì)的閾值，則遺傳毒性雜質(zhì)攝入量最大限值為1.5 μg·d-1[8-9]。依度沙班作為抗凝藥物使用時(shí)，每日通常使用劑量為30 mg，按此計(jì)算含甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯不得過50 μg·g-1。近年來，氣相色譜(GC)法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法和衍生化-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HS-GC-MS)法已被廣泛應(yīng)用于甲磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)[10-11]。筆者參考《歐洲藥典》(EP)8.0 版中關(guān)于甲磺酸鹽中甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯的測(cè)定方法，采用HS-GC-MS法對(duì)甲磺酸依度沙班原料藥中上述3 種遺傳毒性雜質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1儀器 GC-MS 2010 Plus色譜儀(日本Shimadzu公司)；DU305型電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司，感量：0.01 mg)。

1.2試藥 依度沙班原料藥(河北志恒醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：160031，160032，160033)；甲磺酸甲酯對(duì)照品(JSK SCIENTIFIC LTD，批號(hào)：LU80L27)；甲磺酸乙酯對(duì)照品(Atta Aesar，批號(hào)：10169291)；甲磺酸異丙酯對(duì)照品(ACROS，批號(hào)：A0314222)；甲磺酸丁酯(南京強(qiáng)山化工有限公司，批號(hào)：20130027)；乙腈和水均為色譜純，無水碘化鈉和硫代硫酸鈉均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1GC-MS條件 色譜柱為DB-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；檢測(cè)器為MS檢測(cè)器；進(jìn)樣口溫度為110 ℃；采用程序升溫，起始溫度為40 ℃，維持3 min，以20 ℃·min-1的速率升溫至150 ℃，維持2 min，然后以20 ℃·min-1的速率升溫至230 ℃，維持10 min；進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣，分流比20：1；載氣為高純氦氣；柱流量為0.6 mL·min-1；頂空進(jìn)樣，爐溫60 ℃；平衡時(shí)間30 min；進(jìn)樣體積1 mL，進(jìn)樣時(shí)間1 min；離子源溫度200 ℃；接口溫度150 ℃；掃描方式為選擇離子掃描(SIM)；電子能量為70 eV。各待測(cè)成分的定性、定量信息見表1，質(zhì)譜圖見圖1。

表1待測(cè)成分的定性、定量信息

Tab.1Qualitativeandquantativedataoftheingredientundertest

2.2溶液配制

2.2.1衍生化試劑 精密稱取無水碘化鈉60.0 g和硫代硫酸鈉30 mg置50 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

圖1碘代甲烷、碘代乙烷、碘代異丙烷和碘代丁烷的質(zhì)譜圖

Fig.1Massspetrumofmethyliodide,ethyliodide,iso-propyliodideandiodo-2-methylpropane

2.2.2內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取甲磺酸丁酯25 mg，置25 mL量瓶中，加稀釋液(水-乙腈20：80)溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取該溶液50 μL，置于10 mL量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，另精密量取該溶液2 mL，至50 mL量瓶中，加稀釋液稀釋并定容至刻度，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.3空白溶液 精密量取水-乙腈(20：80)0.5 mL與內(nèi)標(biāo)溶液0.5 mL，置20 mL頂空瓶中，立即密封，搖勻，作為空白溶液。

2.2.4對(duì)照品溶液 精密稱取甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯各約50 mg，分別加甲苯溶解并稀釋至10 mL，搖勻；精密量取50 μL，置同一25 mL量瓶中，加內(nèi)標(biāo)溶液稀釋并定容，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液150 μL，置10 mL量瓶中，加內(nèi)標(biāo)溶液稀釋定容，即得。分別精密量取該溶液0.5 mL及衍生化試劑0.5 mL，置20 mL頂空瓶中，立即密封，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2.5供試品溶液 精密稱取樣品30 mg，置20 mL頂空瓶中，加0.5 mL內(nèi)標(biāo)溶液及0.5 mL衍生化試劑，立即壓蓋密封，超聲溶解，作為供試品溶液。

2.3專屬性考察 取空白溶液、甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯對(duì)照品溶液和供試品溶液各1 mL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，記錄色譜圖。內(nèi)標(biāo)衍生物碘代丁烷保留時(shí)間為5.52 min，甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯和甲磺酸異丙酯的衍生物碘代甲烷、碘代乙烷和碘代異丙烷的保留時(shí)間分別為2.87，3.52，3.81 min，各峰之間的分離度均>2.0，符合檢測(cè)要求。

2.4檢測(cè)限和定量限考察 取對(duì)照品溶液，加內(nèi)標(biāo)液逐級(jí)稀釋成不同質(zhì)量濃度，分別精密量取該溶液0.5 mL及衍生化試劑0.5 mL，置20 mL頂空瓶中，搖勻，立即密封。按“2.1”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣，測(cè)定各雜質(zhì)的檢測(cè)限(S/N=3)和定量限(S/N=10)。結(jié)果，甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯和甲磺酸異丙酯檢測(cè)限分別為5，5和10 ng·mL-1，定量限為15，15和30 ng·mL-1。

2.5線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品貯備溶液0.05，0.1，0.5，1.0，3.0 mL，置10 mL量瓶中，加內(nèi)標(biāo)溶液稀釋定容，制得3種成分濃度分別約0.05，0.1，0.5，1.0，3.0 μg·mL-1，分別精密量取該溶液0.5 mL及衍生化試劑0.5 mL，置20 mL頂空瓶中，立即密封，搖勻，作為線性工作溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。以對(duì)照品溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，主成分與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，3種雜質(zhì)的線性結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯和甲磺酸異丙酯均在0.05～3.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表23種成分的線性結(jié)果

Tab.2Linearityofthreekindsofcomponents

成分線性方程r線性范圍/(μg·mL-1)甲磺酸甲酯Y=18 763.82X-156.580.998 50.05～3.0甲磺酸乙酯Y=15 074.22X-112.760.999 00.05～3.0甲磺酸異丙酯Y=10 859.26X-48.630.998 90.05～3.0

2.6精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.5”項(xiàng)下線性工作溶液(3)，按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。經(jīng)計(jì)算得A甲磺酸甲酯/A內(nèi)標(biāo)、A甲磺酸乙酯/A內(nèi)標(biāo)和A甲磺酸異丙酯/A內(nèi)標(biāo)的RSD分別為2.4%，3.0%，2.9%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取樣品(批號(hào)：160031)30 mg，置20 mL頂空瓶中，加入0.15 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL及衍生化試劑0.5 mL，立即壓蓋密封，超聲溶解，按“2.1”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。測(cè)定加標(biāo)樣品中甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯和甲磺酸異丙酯的含量，平行測(cè)定6次。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好，滿足測(cè)定要求。

2.8加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取樣品(批號(hào)：160031)30 mg，共9份，分別置于20 mL頂空瓶中，精密加入對(duì)照品貯備溶液(10 μg·mL-1)2.25， 1.50和0.75 mL，每種濃度平行制備3份進(jìn)行測(cè)定，分別加入衍生化試劑0.5 mL，立即壓蓋密封，超聲溶解，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。根據(jù)內(nèi)標(biāo)法計(jì)算甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯和甲磺酸異丙酯的平均回收率(n=9)分別為96.4%，96.1%和96.5%。結(jié)果見表3。

2.9樣品含量測(cè)定 按“2.1”項(xiàng)色譜條件和“2.2”項(xiàng)對(duì)照品溶液和供試品溶液的制備方法操作，測(cè)定3批原料藥中3種遺傳毒性物質(zhì)，以內(nèi)標(biāo)法計(jì)算甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯和甲磺酸異丙酯的含量，測(cè)定結(jié)果見表4。

表33種成分的回收率結(jié)果

Tab.3Recoveryresultsofthreekindsofcomponents

成分取樣量/mg原有量加入量測(cè)得量μg加樣回收率/%甲磺酸甲酯30.000.004 52.252.2198.0230.000.004 52.252.2097.5830.000.004 52.252.2198.0230.000.004 51.501.4797.7030.000.004 51.501.4697.0330.000.004 51.501.4697.0330.000.004 50.750.7295.4030.000.004 50.750.7092.7330.000.004 50.750.7194.07甲磺酸乙酯30.000.005 72.252.2097.5230.000.005 72.252.1997.0830.000.005 72.252.2197.9730.000.005 71.501.4596.2930.000.005 71.501.4495.6230.000.005 71.501.4696.9530.000.005 70.750.7396.5730.000.005 70.750.7092.5730.000.005 70.750.7193.91甲磺酸異丙酯30.000.000 02.252.1997.3330.000.000 02.252.2298.6730.000.000 02.252.2198.2230.000.000 01.501.4697.3330.000.000 01.501.4596.6730.000.000 01.501.4395.3330.000.000 00.750.7397.3330.000.000 00.750.7093.3330.000.000 00.750.7194.67

表4樣品中3種遺傳毒性物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果

Tab.4Contentdeterminationonthreekindsofgenotoxicimpuritiesinsamplesμg·g-1

批號(hào)甲磺酸甲酯甲磺酸乙酯甲磺酸異丙酯1600310.150.190.001600320.110.170.001600330.090.160.00

3 討論

本研究采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，選取待測(cè)物的同系物甲磺酸丁酯作為內(nèi)標(biāo)物，其衍生化產(chǎn)物為碘代丁烷，與待測(cè)物質(zhì)完全分離，且靈敏度較高。因此，甲磺酸丁酯可作為這3種遺傳毒性雜質(zhì)含量測(cè)定的內(nèi)標(biāo)物。

因本品理化性質(zhì)原因，溶解性較差，在溶劑篩選過程中分別考察了甲醇、異丙醇、二氯甲烷和乙腈等溶劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，選用混合溶劑水-乙腈(20：80)效果最佳。

實(shí)驗(yàn)中考察了不同極性的色譜柱，結(jié)果表明，3種待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物在DB-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)上的峰形和分離度最佳。

實(shí)驗(yàn)采用DB-WAX毛細(xì)管柱內(nèi)徑為0.25 mm，采用常用流速1.0 mL·min-1不能使3種待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物達(dá)到分離度的要求，故考察了1.0，0.8和0.6 mL·min-13種不同流速對(duì)分離度的影響，結(jié)果表明，流速為0.6 mL·min-1時(shí)，分離效果最好。

色譜分離時(shí)，不僅載氣流速影響分離度，而且升溫程序的不同也會(huì)導(dǎo)致色譜峰分離度的變化。由于3種待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的沸點(diǎn)接近，為了使之達(dá)到很好的分離，需采用較低的起始溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，最終選擇40 ℃作為起始溫度，程序升溫進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

頂空條件的優(yōu)化主要考察了兩個(gè)方面，包括爐溫和平衡時(shí)間的選擇。實(shí)驗(yàn)考察了不同爐溫對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果表明，爐溫為60 ℃時(shí)，能夠使3種待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物充分氣化。不僅爐溫會(huì)影響氣化程度，平衡時(shí)間也會(huì)影響氣化程度，不同的平衡時(shí)間直接影響頂空進(jìn)樣的濃度，故考察了平衡時(shí)間的影響，最終選擇平衡時(shí)間為30 min。

本研究采用HS-GC-MS方法對(duì)依度沙班合成過程中可能產(chǎn)生的基因毒性物質(zhì)甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯和甲磺酸異丙酯進(jìn)行含量測(cè)定，對(duì)于確保臨床用藥的安全性和有效性具有重要的意義。