秦 龍 ，李 平 ，2 ，馬克君 ，王儉勤

（1．蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030； 2．甘肅省消化系腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030）

寶腎方膠囊是由大黃 Rheum palmatum L．、黃芪Astragalus membranaceus（Fisch．）Bunge 和藏紅花 Crocussativus組方的醫(yī)院中藥復(fù)方制劑，具有改善腎功能、調(diào)節(jié)脂代謝、降低尿蛋白、延緩慢性腎病進(jìn)展的作用[1]。大黃中的大黃素能調(diào)節(jié)腎臟固有細(xì)胞生長(zhǎng)，減輕腎臟炎癥與免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解[2]。藏紅花中的西紅花苷可調(diào)節(jié)免疫和保護(hù)腎臟[3]。黃芪中的黃芪多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、保肝護(hù)腎和抗腫瘤等作用[4]。為了保證寶腎方膠囊臨床療效的穩(wěn)定性和連續(xù)性，本研究中在保留其傳統(tǒng)中藥湯劑特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，以浸膏得率、大黃素含量和黃芪多糖含量為考察指標(biāo)，對(duì)水煎提取制備工藝進(jìn)行了考察和優(yōu)選。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；HP8453型分光光度計(jì)（美國(guó)惠普公司）；ME215S型電子天平（德國(guó)賽多利斯儀器有限公司）；202A-00型干燥箱（上海新正機(jī)械儀器設(shè)備廠）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

試藥：大黃（批號(hào)為 20130314），黃芪（批號(hào)為20140501），均購(gòu)自定西市天信藥業(yè)有限責(zé)任公司；藏紅花（Badiee Saffron，批號(hào)為 201210）。以上 3味中藥材均經(jīng)甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院宋平順主任藥師鑒定為正品。大黃素對(duì)照品（批號(hào)為110756-200110），葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)為110833-200904），均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 大黃素含量測(cè)定

2．1．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：ZorbaxEclipseXDB-C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 -0．1% 磷酸溶液（85 ∶15）；檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm[5]；柱溫：30 ℃ ；流速：1．0 mL ／min；進(jìn)樣量：5．0 μL。理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)應(yīng)不低于3 000，大黃素與相鄰峰之間分離度均大于1．5。色譜圖見圖1。

2．1．2 溶液制備

稱取大黃素對(duì)照品4．3 mg，精密稱定，置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度定容，搖勻；精密量取1．0 mL，置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度定容，搖勻，配制成每1 mL含43 μg大黃素的溶液，即得對(duì)照品溶液。分別稱取9份正交試驗(yàn)項(xiàng)下浸膏樣品(各 0．2 g)，精密稱定，置 100 mL圓底燒瓶中，加30 mL 硫酸溶液（2．5 mol／L）超聲處理 5 min，再加入30 mL氯仿，回流1．5 h，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，萃取，分取氯仿層，水相再加30 mL氯仿萃取3次，分取氯仿層，合并4次氯仿萃取液，水浴回收氯仿，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋蒸至干，殘?jiān)蛹状?．0 mL使溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取1．0 mL置5 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得供試品溶液。按1／2處方量配制缺大黃的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2．1．3 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密量取大黃素對(duì)照品溶液0．1，0．2，0．4，0．8，1．6，2．4 mL，分別置 10 mL 棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度定容，搖勻，配制成系列溶液，用0．22 μm微孔濾膜濾過，移至進(jìn)樣小瓶中，精密量取5．0 μL，自動(dòng)進(jìn)樣，記錄色譜圖（圖 1），以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程 Y＝62．060 4X-8．681 3，r＝0．999 9（n＝6）。結(jié)果表明，大黃素質(zhì)量濃度在 0．43～10．32 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：在擬訂色譜條件下，精密量取大黃素對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD為0．16%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：在擬訂色譜條件下，精密量取同一供試品溶液，分別于 0，1，2，4，6，8，10 h 時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD為 0．48%（n＝7），表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：按1／2處方量稱取樣品內(nèi)容物，依法制備供試品溶液，在擬訂色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)定峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果大黃素平均含量為3．126 mg／g，RSD為1．21%（n＝6），表明方法重復(fù)性較好。

加樣回收試驗(yàn)：稱取已知含量的同一批浸膏樣品各0．2 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，精密量取2．0 mL，置5 mL容量瓶中，再按已知含量的80%，100%，120%（低、中、高）3個(gè)體積分?jǐn)?shù)，分別精密加入稀釋10倍后的對(duì)照品溶液（4．3 μg ／mL）1．0，1．2，1．4 mL，加甲醇定容，搖勻，在擬訂色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

2．2 黃芪多糖含量測(cè)定[6]

2．2．1 溶液制備

稱取葡萄糖對(duì)照品250 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加30 mL純化水溶解，稀釋至刻度定容，搖勻；精密量取1．0 mL，置50 mL容量瓶中，加純化水稀釋至刻度，搖勻，配制成每1 mL含葡萄糖0．1 mg的溶液，即得對(duì)照品溶液。分別稱取9份正交試驗(yàn)項(xiàng)下浸膏樣品(各 0．2 g)，精密稱定，置 50 mL三角瓶中，加30mL純化水超聲處理30 min，濾過，濾液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加純化水稀釋至刻度，搖勻，精密量取20 mL，置50 mL容量瓶中，加純化水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取2．0 mL純化水，置10 mL干燥試管中，依次分別加入 5%苯酚溶液 1．6 mL，濃硫酸 6．0 mL，搖勻，放置30 min，作為空白溶液。

2．2．2 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密量取 2．2．1項(xiàng)下對(duì)照品溶液0．6，0．7，0．8，0．9，1．0，1．1 mL，分別置 10 mL 干燥試管中，均加純化水補(bǔ)足 2．0 mL，分別加入 5%苯酚溶液1．6 mL 和濃硫酸 6．0 mL，搖勻，室溫避光放置 30 min，以空白溶液為參比溶液，按分光光度法于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A＝16．726 4 C-0．111 4，r＝0．999 5（n＝6）。結(jié)果表明，葡萄糖質(zhì)量濃度在 0．03～0．055 mg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表1 大黃素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

精密度試驗(yàn)：精密量取2．2．1項(xiàng)下對(duì)照品溶液6份，各2．0 mL，分別置10 mL試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度。結(jié)果的 RSD為 0．21%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：分別精密量取2．2．1項(xiàng)下對(duì)照品溶液和供試品溶液各 2．0 mL，置10 mL試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，前1 h每隔10 min測(cè)1次，后1 h每隔20 min測(cè)1次。結(jié)果的 RSD對(duì)照品溶液為 1．39% （n＝9），供試品溶液為 1．55% （n＝9），表明待測(cè)溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：按1／2處方量稱取樣品內(nèi)容物，依法制備供試品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度并計(jì)算含量。結(jié)果黃芪多糖平均含量為 45．19 mg／g，RSD為1．23%（n＝6），表明方法重復(fù)性較好。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取已知含量的同一批浸膏樣品各0．2 g，依法制備供試品溶液，分別精密量取1．0 mL，置10 mL試管中，再按80%，100%，120%（低、中、高）3個(gè)體積分?jǐn)?shù)分別加入葡萄糖對(duì)照品溶液 0．3，0．4，0．5 mL，加純化水補(bǔ)足至2．0 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度。結(jié)果見表1。

2．3 制備工藝正交試驗(yàn)

因素與水平：采用正交試驗(yàn)，以加水倍數(shù)（因素A）、提取時(shí)間（因素B）和提取次數(shù)（因素C）為考察指標(biāo)，每個(gè)指標(biāo)選擇3個(gè)水平，選用 L9（34）正交表試驗(yàn)。各因素及水平見表2。

表2 因素水平表

正交試驗(yàn)結(jié)果：按 1／2處方量稱取大黃 5．0 g，黃芪 10．0 g，共 9 份，按 L9（34）正交表進(jìn)行水煎提取試驗(yàn)，水煎液過濾，合并濾液，濃縮，移至蒸發(fā)皿中，置烘箱中60℃烘至恒定質(zhì)量，分別加入西紅花 1．0 g，研細(xì)，混勻。依法測(cè)定浸膏得率、大黃素含量和黃芪多糖含量，計(jì)算這3種指標(biāo)的綜合評(píng)分并進(jìn)行方差分析。結(jié)果見表3和表4。由表3可見，水煎提取工藝影響因素的影響強(qiáng)度依次為C＞A＞B，即提取次數(shù)（C）＞加水倍數(shù)（A）＞提取時(shí)間（B）。由表4可見，因素 C的影響較大（P＜0．05），因素A和因素B的影響不大（P＞0．05）。故選定水煎工藝的最佳制備條件為A3B1C3，即按處方量稱取大黃和黃芪，加16倍量的純化水，水煎提取4次，每次2 h，水煎提取液合并，濾過，濾液濃縮至相對(duì)密度為1．25～1．30的浸膏，置烘箱中60℃烘至恒定質(zhì)量，取出，粉碎，加入粉碎的藏紅花，混勻，制粒，過80目篩，裝入1號(hào)膠囊，即得。

表 3 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 正交試驗(yàn)方差分析表

2．4 最佳工藝驗(yàn)證

為了考察最佳工藝的穩(wěn)定性，在最佳制備工藝條件下分別對(duì)3批寶腎方膠囊樣品進(jìn)行驗(yàn)證，分別測(cè)定浸膏得率、大黃素含量和黃芪多糖含量，結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，優(yōu)選制備工藝合理可行、穩(wěn)定，可用于控制制劑的質(zhì)量。

表5 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）

3 討論

寶腎方是在現(xiàn)代研究的基礎(chǔ)上，借鑒古代醫(yī)家扶正益腎、除濕祛毒的辨證施治原則，并結(jié)合臨床應(yīng)用化裁而來的經(jīng)驗(yàn)方。方中大黃活性成分主要為蒽醌類化合物[7]，本研究中測(cè)定大黃素含量時(shí)曾考慮測(cè)定浸膏中游離蒽醌含量，結(jié)果大黃素含量較低。故采用2015年版《中國(guó)藥典（一部）》中大黃含量測(cè)定項(xiàng)下總蒽醌含量測(cè)定方法。曾采用甲醇 -0．1% 磷酸（90 ∶10，V／V）作為流動(dòng)相，結(jié)果供試品中的大黃素與雜峰分離度小于1．5，影響檢測(cè)結(jié)果，反復(fù)測(cè)試后選擇流動(dòng)相為甲醇-0．1% 磷酸溶液（85 ∶15，V／V）。黃芪多糖具有促進(jìn)抗體生成和免疫反應(yīng)等作用，其水溶性好，一般采用水煎法提取。藏紅花為貴重藥材，故在浸膏烘干后直接粉碎加入，避免活性成分損失。

本研究中以大黃素和黃芪多糖為主要考察指標(biāo)，同時(shí)加入了浸膏得率作為輔助考察指標(biāo)，這樣既保留了傳統(tǒng)中藥湯劑的提取方法，又利用現(xiàn)在藥學(xué)技術(shù)，體現(xiàn)了中藥的整體復(fù)方功效。因此，確定以浸膏得率、大黃素含量和黃芪多糖含量3種指標(biāo)的綜合評(píng)分來優(yōu)選最佳工藝，以保證制劑質(zhì)量的穩(wěn)定性。綜合上述因素，按現(xiàn)代藥劑學(xué)技術(shù)優(yōu)化制備工藝條件，集成為寶腎方膠囊，以期使該制劑高效、低毒，并減少不良反應(yīng)。