耿德海 ，郭文龍 ，王 強(qiáng) ，劉志勇 ，薛 娟 ，孫曉芳 ，谷 雨 ，劉未華 ，段 斐

（1．河北省保定市第二醫(yī)院，河北 保定 071051； 2．河北省保定市淶水縣醫(yī)院，河北 保定 074100；3．河北省保定市法醫(yī)醫(yī)院，河北 保定 071000； 4．河北大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000）

肺纖維化是多種慢性肺疾病的共同結(jié)局，其發(fā)病機(jī)制至今不明。有研究發(fā)現(xiàn)，肺纖維化后期主要表現(xiàn)為正常肺組織逐漸被增殖分化的成纖維細(xì)胞和過度聚集的膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)替代[1]。因此，肺成纖維細(xì)胞的增殖在肺纖維化的發(fā)生過程中起重要作用，而由其分泌的Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其含量的變化和比例的改變是肺纖維化的主要病理學(xué)基礎(chǔ)。三七總皂苷是三七主要有效藥用成分，具有活血祛瘀、通脈活絡(luò)等功效，并能抗腫瘤、抗纖維化、抑制血小板聚集和增加腦血流量等[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷對(duì)肺上皮細(xì)胞的凋亡，肺纖維化狀態(tài)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，以及肺組織中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)均有抑制作用，說明三七總皂苷有預(yù)防肺纖維化的作用[3-6]。本研究中通過體外培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5，研究三七總皂苷對(duì)MRC-5的增殖分化及膠原蛋白表達(dá)的影響，以探討三七總皂苷阻斷肺纖維化進(jìn)程的體外細(xì)胞分子機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 儀器與試藥

儀器：日產(chǎn)超凈工作臺(tái)（日本 Airtech公司）；HF90型CO2培養(yǎng)箱（香港力康生物醫(yī)療科技有限公司）；CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；ZHWY-10X型恒溫水浴箱（上海申安醫(yī)療器械廠）；BIORAD680型酶標(biāo)儀（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）。

試藥：人胚肺成纖維細(xì)胞系（北京協(xié)和細(xì)胞資源中心，細(xì)胞株編號(hào)為MRC-5）；DMEM／EBSS細(xì)胞培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；NEAA培養(yǎng)基（北京協(xié)和細(xì)胞資源中心）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；三七總皂苷注射液（昆明制藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)為20150313，規(guī)格為每支 5 mL ∶250 mg）；二甲基亞砜、四氮唑(MTT)均由美國(guó)Sigma公司提供；胰蛋白酶（美國(guó)Amresco公司）；即用型免疫組化試劑盒、辣根過氧化物酶顯色(DBA)液均由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1．2 方法

細(xì)胞分組及給藥：將體外培養(yǎng)的人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5分為4組：正常對(duì)照組，不做處理；模型組，加入轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β，質(zhì)量濃度為1ng／mL）；陽性藥物對(duì)照組（地塞米松組），加入TGF-β（質(zhì)量濃度為1 ng／mL）＋地塞米松（質(zhì)量濃度為 0．05 g／L）；三七總皂苷組，加入TGF-β（質(zhì)量濃度為 1 ng／mL）＋三七總皂苷（質(zhì)量濃度為1 g／L）。將細(xì)胞接種于96孔板，每組各5個(gè)復(fù)孔。加藥后充分混勻，孵育24 h。

MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況：MRC-5培養(yǎng)24 h后，各組加入相應(yīng)藥物干預(yù)，分別孵育24 h和72 h后，采用MTT比色法檢測(cè)。于試驗(yàn)前4 h取出96孔板，避光條件下加入質(zhì)量濃度為5g／L的MTT20 μL，放入培養(yǎng)箱，孵育4 h，棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜150 mL，振蕩混勻10 min后放入酶標(biāo)儀，讀取490 nm波長(zhǎng)下各孔光密度（OD）值，計(jì)算各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞各指標(biāo)表達(dá)情況：將細(xì)胞濃度調(diào)整到約為 1×105個(gè)／mL，37℃ 培養(yǎng) 24 h。各組加入相應(yīng)藥物，正常對(duì)照組加入等量培養(yǎng)基，共孵育72 h。取出后棄去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3遍，每孔加入冷丙酮2 mL，放入4℃固定10 min，棄去丙酮，取出細(xì)胞爬片，染色，脫水，封片，采用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)(SP)法檢測(cè)各組α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和膠原蛋白表達(dá)情況，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況；采用Image pro-plus圖像分析系統(tǒng)，每張爬片選取5個(gè)不同視野檢測(cè)，計(jì)算各組累積光密度值（IOD），以此為蛋白表達(dá)水平。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2．1 對(duì)細(xì)胞增殖的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組MRC-5 24 h和72 h后增殖明顯；地塞米松組和三七總皂苷組成纖維增殖顯著受到抑制，且抑制程度隨干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，但組間無顯著差異。詳見表1。

表1 三七總皂苷對(duì)MRC-5增殖比的影響（s，n＝5）

表1 三七總皂苷對(duì)MRC-5增殖比的影響（s，n＝5）

注：與正常對(duì)照組比較，＃P＜ 0．05；與模型組比較，P ＜0．05。表 2 同。

組別正常對(duì)照組模型組地塞米松組三七總皂苷組24 h 0．282 ± 0．025 0．366 ± 0．036＃0．314 ± 0．005 0．305 ± 0．101 72 h 0．367 ± 0．176 0．436 ± 0．028＃0．358 ± 0．012 0．356 ± 0．009

2．2 對(duì)細(xì)胞 -SMA蛋白表達(dá)水平的影響

模型組有大量棕褐色著色細(xì)胞表達(dá)；與模型組相比，地塞米松組和三七總皂苷組棕褐色細(xì)胞顯著減少；與正常對(duì)照組比較，模型組α-SMA蛋白表達(dá)水平升高（P＜0．05）；與模型組比較，地塞米松組和三七總皂苷組 α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0．05）。詳見圖1和表2。

圖1 三七總皂苷對(duì)MRC-5細(xì)胞 -SMA蛋白表達(dá)的影響（SP，× 200）

表2 三七總皂苷對(duì)肺成纖維細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響（n＝5）

2．3 對(duì)Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組黃褐色細(xì)胞數(shù)量明顯增多，顯示細(xì)胞蛋白表達(dá)量較正常對(duì)照組顯著增加；與模型組比較，地塞米松組和三七總皂苷組黃褐色細(xì)胞數(shù)量明顯減少，顯示其Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)量較模型組顯著降低，地塞米松組和三七總皂苷組比較無顯著差異。詳見圖2、圖3及表2。

圖2 三七總皂苷對(duì)MRC-5細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)量的影響（SP，× 100）

圖3 三七總皂苷對(duì)各組MRC-5細(xì)胞Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)量的影響（SP，×100）

3 討論

肺纖維化是以彌漫性肺間質(zhì)改變?yōu)橹饕卣鞯姆渭膊。渲饕±碜兓癁槌衫w維細(xì)胞增殖分化和細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生增多。肺成纖維細(xì)胞是產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的最主要細(xì)胞，其過度增殖分化是導(dǎo)致肺膠原蛋白合成增多和異常沉積的主要原因[7]。因此，通過抑制肺成纖維細(xì)胞增殖分化和細(xì)胞外基質(zhì)的合成對(duì)于防治特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化有重要意義。本研究結(jié)果顯示，三七總皂苷可抑制肺成纖維細(xì)胞的增殖分化，并減少其膠原蛋白的合成。

研究發(fā)現(xiàn)，肺成纖維細(xì)胞增殖分化為表達(dá)α-SMA的肌成纖維細(xì)胞是合成細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞[8]。肌成纖維細(xì)胞由成纖維細(xì)胞分化而來，特征性表達(dá)α-SMA，具有更強(qiáng)的促肺纖維化作用。這種增殖分化受多種調(diào)控因子的影響，其中，TGF-β是最重要的促進(jìn)因子，也是促肺纖維化的重要因子，可促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其分化為肌成纖維細(xì)胞[9]。肌成纖維細(xì)胞可產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)，如α-SMA，Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白等，導(dǎo)致細(xì)胞重塑，進(jìn)而促進(jìn)TGF-β誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞活化為肌成纖維細(xì)胞，從而放大纖維化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[10]。因此，抑制肺成纖維細(xì)胞的增殖分化對(duì)于肺纖維化的防治具有重要意義。

膠原蛋白是肺纖維化細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，膠原蛋白的分解減少和合成增加是導(dǎo)致肺纖維化膠原蛋白異常沉積的重要原因[11]。而這種異常又以Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白代謝異常為主。在肺纖維化的早期、晚期分別主要以Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白增加為主[12]。因此，通過藥物抑制此兩種膠原蛋白的表達(dá)將有助于肺纖維化的治療。

多項(xiàng)以肺纖維化模型大鼠為對(duì)象的研究發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷具有抑制TGF-β合成與分泌的作用，對(duì)肺纖維化模型大鼠有顯著抗纖維化作用[13]。此外，三七總皂苷對(duì)肝纖維化、腎纖維化及腹膜纖維化等均有抑制作用[14-16]。本研究結(jié)果顯示，TGF-β可顯著促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞的增殖，并使其α-SMA受體表達(dá)增強(qiáng)，表明TGF-β可促進(jìn)肺纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)肺纖維化的發(fā)展。經(jīng)過三七總皂苷干預(yù)后，細(xì)胞增殖受到抑制，同時(shí)α-SMA蛋白表達(dá)水平亦有下降趨勢(shì)，表明三七總皂苷可顯著抑制肺成纖維細(xì)胞的增殖和分化，可能是其治療肺纖維化的機(jī)制之一。

通過對(duì)肺成纖維細(xì)胞Ⅰ型、Ⅲ 型膠原蛋白纖維表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β可顯著增加膠原蛋白的表達(dá)量，三七總皂苷對(duì)肺纖維細(xì)胞的Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)量有顯著抑制作用，可降低細(xì)胞外基質(zhì)沉積，從而防止肺纖維化產(chǎn)生。

綜上所述，三七總皂苷能抑制肺成纖維細(xì)胞的增殖及向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，抑制Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白合成，這些作用可能是其防治肺間質(zhì)纖維化的機(jī)制。