王林軍

（新汶礦業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司中心醫(yī)院藥學(xué)部，山東 泰安 271233）

環(huán)孢素是目前移植領(lǐng)域最常用的免疫抑制藥物，其抗排異作用與用藥劑量密切相關(guān)，但該藥品不良反應(yīng)多且與用藥劑量過大有關(guān)，故臨床需要對其進(jìn)行血液濃度監(jiān)測，以保證用藥安全有效[1]。患者在造血干細(xì)胞移植后的并發(fā)癥控制是提高惡性血液病療效的重要環(huán)節(jié)，而感染是導(dǎo)致移植失敗甚至致死的主要原因，因此，惡性血液病患者行造血干細(xì)胞移植后除了服用免疫抑制劑外，往往還需同時(shí)服用多種藥物[2-3]。當(dāng)移植患者并發(fā)真菌感染時(shí)，多需聯(lián)合使用抗真菌藥物，其中伏立康唑?qū)購V譜三唑類抗真菌藥物，用于治療非中性粒細(xì)胞減少患者的念珠菌血癥，可有效治療原發(fā)性或急救性的亞急性侵襲性感染和慢性肺曲霉病等，美國感染病學(xué)會(huì)（IDSA）制訂的曲霉病治療指南中，伏立康唑是治療侵襲性曲霉病的首選藥物，移植患者出現(xiàn)該真菌感染后往往需合并使用該藥物，而該藥物在體內(nèi)的代謝具有多態(tài)性，即使使用相同劑量，血藥濃度也因人而異，因此，該藥臨床使用同樣需要進(jìn)行血液濃度監(jiān)測[4-5]。此外，其與環(huán)孢素A聯(lián)合使用導(dǎo)致的藥品不良反應(yīng)多有報(bào)道[6]。本研究中旨在建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確且能同時(shí)測定兩藥血藥濃度的分析方法，為臨床監(jiān)測其血藥濃度提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；208型Milli-Q10純水器 （美國Millipore公司）；AEG-120型電子分析天平（日本島津公司）；TGL-20M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湘儀儀器有限公司）。

1．2 試藥

環(huán)孢素A對照品（百靈威試劑公司，純度為99．7%）；伏立康唑?qū)φ掌罚ㄖ袊称匪幤窓z定研究院，批號為100862-201701）；內(nèi)標(biāo)為醋酸可的松及熊果酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為171217-201702，110709-201704）；乙腈（美國 Fisher公司）、醋酸銨（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號為20170208）為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件及專屬性試驗(yàn)

色譜柱：Diamonsil RP-C18柱（150 mm× 4．6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈 -0．01mol／L 醋酸銨水溶液（65∶35）；流速：1．0 mL ／min；柱溫：35 ℃；檢測波長：215 nm（環(huán)孢素 A），256 nm（伏立康唑）；進(jìn)樣量：20 μL。在此色譜條件下，分別考察空白血清、環(huán)孢素A、伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品及血清樣品的色譜圖，結(jié)果血清中內(nèi)源性雜質(zhì)不影響環(huán)孢素A與伏立康唑的分離度，內(nèi)源性物質(zhì)無干擾，伏立康唑及環(huán)孢素A保留時(shí)間分別為5．32 min和6．48 min。詳見圖1。

2．2 溶液制備

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：稱取環(huán)孢素A 10．00 mg，伏立康唑?qū)φ掌?0 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，分別用甲醇溶解并定容，即得環(huán)孢素A質(zhì)量濃度為1 g／L，伏立康唑質(zhì)量濃度為5 g／L的對照品貯備液，于4℃下保存。取貯備液適量，用甲醇稀釋，配制系列濃度的對照品工作液待用。稱取熊果酸10．00 mg、醋酸可的松50 mg為內(nèi)標(biāo)，精密稱定，置 25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得內(nèi)標(biāo)溶液（質(zhì)量濃度分別為400 μg／mL和2 000 μg／mL ），于 4 ℃下保存。

圖1 高效液相色譜圖

表1 精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn)（n＝5）

血清樣品處理：量取血清樣品 200 μL，1．5 mL離心管中，隨即加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，充分混勻，加入乙腈400 μL，渦旋振蕩 2 min，沉淀蛋白，以 12 000 r／min 的速率，離心 15 min，取上清液，氮?dú)獯蹈桑?00 μL流動(dòng)相復(fù)溶，待分析。

2．3 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別取不同質(zhì)量濃度的環(huán)孢素A及伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL，加入1 800 μL血清中，混勻，配置環(huán)孢素 A終質(zhì)量濃度分別為 30，90，150，300，600，1 000，1 200，1 500 ng／mL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品；伏立康唑終質(zhì)量濃度分別為 200，1 000，2 000，3 000，4 000，6 000，8 000，10 000 ng／mL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。按血清樣品處理方法處理，以環(huán)孢素A或伏立康唑質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、環(huán)孢素A或伏立康唑峰面積與內(nèi)標(biāo)面積比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，環(huán)孢素A為Y＝68．7 X＋6．241(r＝0．999 4，n＝8)，伏 立 康 唑 為Y＝264．1 X＋9．547(r＝0．999 2，n＝8)，環(huán)孢素 A 與伏立康唑質(zhì)量濃度線性范圍分別為30～1 500 ng／mL和 200～10 000 ng／mL[信噪比（S／N）≥3]。

精密度試驗(yàn)：分別配制環(huán)孢素A質(zhì)量濃度為30，600，1 500 ng／mL，伏立康唑質(zhì)量濃度為 200，4 000，10 000 ng／mL的血漿樣品，每個(gè)樣品平行配制5份，按血清樣品處理方法處理，按隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度，考察方法學(xué)日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果見表1。環(huán)孢素A及伏立康唑日內(nèi)、日間精密度均符合生物樣品檢測標(biāo)準(zhǔn)，RSD均小于15%(n＝5)。

準(zhǔn)確度試驗(yàn)：血漿樣品配制與操作方法同“精密度試驗(yàn)”，結(jié)果見表1?？梢?，該方法準(zhǔn)確度符合生物樣品檢測標(biāo)準(zhǔn)。

樣品穩(wěn)定性：血漿樣品配制方法同“精密度試驗(yàn)”，于室溫下放置 0，6，12 h 及 4 ℃下貯存 6，12，24 h 后，按血清樣品處理方法處理。結(jié)果見表2，可見，血清樣品在室溫存放12 h內(nèi)和4℃存放24 h內(nèi)穩(wěn)定性均良好，RSD符合生物樣品檢測標(biāo)準(zhǔn)。

長期穩(wěn)定性試驗(yàn)：血漿樣品配制方法同“精密度試驗(yàn)”，-20℃冷凍貯存，分別于第0，3，7天取出，樣品自然溶解后，按血清樣品處理方法處理。結(jié)果見表3，血清樣品在0～7 d內(nèi)冷凍存放，穩(wěn)定性良好，樣品的 RSD均小于15%(n＝5)，符合檢測標(biāo)準(zhǔn)。

表2 室溫及4℃血清樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）

表3 血清樣品長期穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）

進(jìn)樣待測樣品穩(wěn)定性：血漿樣品配制方法同“精密度試驗(yàn)”，按血清樣品處理方法處理，分別于進(jìn)樣前將待測樣品于室溫下放置0，6，12 h及4℃下貯存6，12，24 h后再進(jìn)樣檢測。結(jié)果見表4?？梢?，不同質(zhì)量濃度進(jìn)樣待測樣品在室溫條件下存放12 h以內(nèi)及4℃條件下存放24 h的穩(wěn)定性良好，樣品 RSD均小于15%(n＝5)，符合檢測標(biāo)準(zhǔn)。

表4 室溫及4℃條件下進(jìn)樣待測樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）

3 討論

環(huán)孢素A又稱環(huán)孢菌素A，為臨床常用免疫抑制劑，主要給藥途徑為口服或靜脈給藥，但口服吸收率低且不規(guī)則，且有顯著的肝、腎毒性，不同人群及個(gè)體口服給藥后血藥濃度差異大，臨床療效也有顯著差異，因此，有效監(jiān)測血藥濃度是該藥減毒增效的必要手段。環(huán)孢素A主要通過肝藥酶CYP3A代謝，而CYP3A家族主要參與環(huán)孢素A代謝的CYP3A4和CYP3A5存在基因突變，可導(dǎo)致機(jī)體對環(huán)孢素的代謝加速，致血藥濃度降低，顯著降低療效[6-8]。此外，由于其主要有 CYP3A4及CYP3A5代謝，因此環(huán)孢素A與影響CYP3A的藥物合用時(shí)，可引起藥物相互作用，影響療效，甚至發(fā)生毒副作用[9-10]。伏立康唑是臨床治療危重真菌感染的一線用藥，移植患者易發(fā)生感染等并發(fā)癥，當(dāng)發(fā)生真菌感染后多數(shù)患者使用伏立康唑。該藥物主要通過肝臟細(xì)胞色素P450 同工酶 CYP2C19，CYP2C9 和 CYP3A4 代謝[11]。其中CYP2C19是主要代謝酶，由于其基因多態(tài)性導(dǎo)致不同人群服用伏立康唑后體內(nèi)血液濃度差異較大[12]。同時(shí)，該藥經(jīng)CYP3A4代謝，當(dāng)其與環(huán)孢素A聯(lián)用時(shí)，可導(dǎo)致環(huán)孢素A血藥濃度升高，引起毒性反應(yīng)。有研究表明，兩藥合用可導(dǎo)致高血鉀反應(yīng)[13]或癲癇樣反應(yīng)[14-15]。因此，針對兩藥聯(lián)用的患者應(yīng)進(jìn)行有效的血藥濃度監(jiān)測，但現(xiàn)有監(jiān)測方法均為獨(dú)立監(jiān)測2種藥物[16-18]，同一個(gè)血樣需采用不同的監(jiān)測方法，效率低。此外，部分醫(yī)院不同的藥物樣品往往采取集中監(jiān)測，導(dǎo)致2種藥物的監(jiān)測結(jié)果存在時(shí)間差異，不能有效、及時(shí)地指導(dǎo)臨床治療。

本研究中建立的雙波長高效液相色譜法，其精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性等符合標(biāo)準(zhǔn)，表明該方法可同時(shí)檢測血清樣品中環(huán)孢素A及伏立康唑的血藥濃度，節(jié)省檢測時(shí)間，為臨床同時(shí)監(jiān)測兩藥提供了有效手段。