邢夢雨 夏道宗 田崇梅 張曉熙 郭璐 趙鑫鈺

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053

楓楊（Pterocarya stenoptera，P.stenoptera）為胡桃科楓楊屬植物，味辛、溫，有小毒，具有消腫止痛、解熱殺蟲的功效，其葉與樹皮在民間常用作傳統(tǒng)外用中藥，主治濕疹、過敏性皮炎以及各類真菌性皮膚病和細(xì)菌性膿瘡[1]。研究證實，楓楊的各部位對多種細(xì)菌如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈格孢菌、卡拉雙球菌等均有抑制作用[2-4]。其中，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus） 是一種廣泛存在于自然界中的高致病性常見菌，能夠引起食物中毒、腦膜炎、心內(nèi)膜炎和術(shù)后傷口感染等多種感染性疾病[5-6]。目前關(guān)于楓楊對金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)制的相關(guān)研究較少，本研究擬以楓楊葉為對象，采用紙片擴(kuò)散法篩選楓楊葉不同溶劑提取物的抑菌效果，并系統(tǒng)研究抑菌規(guī)律及相關(guān)作用機(jī)制，以期為開發(fā)新型安全高效的植物源性抗菌劑以及對楓楊葉的深入利用與加工提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株 金黃色葡萄球菌菌株（ATCC 25923）由浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供，實驗所用為第3代，活化于LB培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基由胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉5g、無菌雙蒸水1 000mL配制，調(diào)整 pH 為 7.2～7.4。

1.2 藥品和試劑 楓楊葉采摘于錢塘江畔，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)陳孔榮副教授鑒定為胡桃科楓楊屬植物楓楊的樹葉。酵母浸膏購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司（批號：3206071）；胰蛋白胨、瓊脂粉均購于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司（批號：20180220、20180503）；DL5000DNA Marker 購 于TaKaRa公司（批號：A1901A）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO） 購于 BioFroxx公司 (批號：EZ1609C224)；氨芐青霉素鈉與鹽酸四環(huán)素購于上海生工公司（批號：E425KA8318、E410KA8176）；LIVE/DEAD BacLight Bacter ial Viability Kit購于Thermo Fisher公司（批號：1937182）；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購于北京百泰克生物公司（批號：DP2001）；溶菌酶購于 Sigma公司（批號：SLBW4358）。

1.3 主要儀器 BSA224S-CW分析天平購自賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；Synergy H1多功能微孔板檢測儀購于美國Bio Tek公司；5427R高速離心機(jī)購于德國Eppendorf公司；SU-8010N型場發(fā)射掃描電子顯微鏡為日本HITACHI公司產(chǎn)品；Ti-S型倒置熒光顯微鏡購于日本Nikon公司；GenoSens 1850凝膠成像儀購于上海勤翔公司。

1.4 方法

1.4.1 楓楊葉提取物的制備 干燥楓楊葉粉碎過40目篩，稱取一定質(zhì)量，按1:10比例加入水或90%乙醇，室溫浸泡20min后，60℃熱回流法提取2次，抽濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至適量，冷凍干燥制成凍干粉，置干燥器內(nèi)保藏待用。

1.4.2 菌液的制備 為確保使用相同濃度的菌液，在評估抗菌活性之前，于600nm處測定吸光度，OD600=0.5相應(yīng)的菌種濃度為1.0×108CFU·mL-1。將菌種重懸于LB培養(yǎng)基中，使用前稀釋至待用濃度。

1.4.3 抑菌活性篩選 采用紙片擴(kuò)散法篩選楓楊葉不同溶劑提取物的抑菌活性[7]。稱取不同溶劑提取的凍干粉50mg，分別加入含有體積分?jǐn)?shù)5%DMSO的0.85%氯化鈉溶液0.5mL，超聲溶解后以0.22μm的無菌濾膜濾過，加入100個直徑6mm的無菌濾紙片，平鋪于無菌平板內(nèi)，37℃烘干備用，每個紙片含提取物500μg。以含量為20μg/片的鹽酸四環(huán)素與氨芐青霉素鈉紙片作為陽性對照，無菌雙蒸水作為空白對照。吸取1.0×108CFU·mL-1的菌液100μL涂布于平板上，以涂布棒涂布均勻，制成含菌平板。將含藥紙片貼于含菌平板表面，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h，使用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。

1.4.4 最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）與最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）的測定 參照Othman等[8]方法并稍作修改。使用96孔板，將楓楊葉醇提取物以LB培養(yǎng)基對半稀釋，并將100μL提取物溶液與100μL菌液混合，使提取物終濃度為 31.25～1 000mg·L-1，金黃色葡萄球菌終濃度為1.0×105CFU·mL-1，以鹽酸四環(huán)素與氨芐青霉素鈉1.56～50mg·L-1作為陽性對照。DMSO體積分?jǐn)?shù)最高為5%，已證明對微生物生長無影響。將96孔板密封于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，無可見細(xì)菌生長的孔（OD增量＜0.1）對應(yīng)的最低提取物濃度即為MIC。將每孔等分試樣涂布在LB固體培養(yǎng)基上，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，確定存活細(xì)菌數(shù)量。存活細(xì)菌數(shù)量至少減少3個數(shù)量級，相應(yīng)的最低提取物濃度即為MBC。

1.4.5 抑菌曲線的繪制 采用生長曲線法測定楓楊葉醇提取物對細(xì)菌生長的影響[9]。將對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌按照1.0×106CFU·mL-1的濃度接種于含有125mg·L-1（1×MIC）、250mg·L-1（2×MIC）和500mg·L-1（4×MIC）的楓楊葉醇提物及空白培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。每隔2h取菌懸液測定其600nm波長處的吸光度，繪制生長曲線。

1.4.6 掃描電子顯微鏡觀察菌體形態(tài) 以終濃度250mg·L-1（2×MIC）的楓楊葉醇提取物和0.85%氯化鈉溶液分別于37℃處理金黃色葡萄球菌菌液24h，根據(jù)倪方方等[10]的方法制作掃描電鏡標(biāo)本。將0.85%氯化鈉溶液處理的菌體設(shè)為空白對照組，以pH=7.2的PBS洗滌并收集空白對照組和楓楊葉醇提取物處理后的菌體，2.5%戊二醛4℃固定過夜。將固定的菌體以PBS洗3次，1%鋨酸固定20min。依次經(jīng)50%、75%、90%、100%乙醇和 50%、75%、90%、100%叔丁醇梯度脫水，真空干燥后噴金包覆。使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡在1.5kV的加速電壓下檢測。

1.4.7 熒光顯微鏡分析細(xì)胞膜損傷 使用熒光顯微鏡觀察楓楊葉醇提取物對金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的損傷作用[11]。以0.85%氯化鈉溶液溶解楓楊葉醇提取物，調(diào)整終濃度為125mg·L-1（1×MIC）和500mg·L-1（4×MIC）。取對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌，接種終濃度為1.0×108CFU·mL-1，各組分別于37℃孵育0.5、24h，根據(jù)試劑說明書進(jìn)行SYTO9和碘化丙啶（propidium iodide，PI）熒光染色，室溫避光孵育15min后，吸取5μL樣品固定于載玻片上，使用U-RFL-T汞燈作為激發(fā)源，并通過SYTO9（450～480nm）和PI（510～550nm）兩個單獨(dú)發(fā)射濾光器收集熒光信號，200倍熒光顯微鏡下觀察，每組觀察3張涂片，計算視野中綠色熒光與紅色熒光的強(qiáng)度比RatioG/R。

1.4.8 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA損傷 金黃色葡萄球菌基因組DNA損傷檢測參考Yadav等[12]的方法并稍作改動。以125mg·L-1（1×MIC）、250mg·L-1（2×MIC）和500mg·L-1（4×MIC）楓楊葉醇提取物處理金黃色葡萄球菌6h后，根據(jù)試劑盒說明書提取金黃色葡萄球菌基因組DNA，0.8%瓊脂糖凝膠100V恒壓電泳30min，紫外燈下觀察并拍照記錄。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組抑菌活性比較 紙片擴(kuò)散實驗結(jié)果提示，楓楊葉醇提取物對金黃色葡萄球菌有抑制作用，而水提取物基本無抑菌作用。進(jìn)一步結(jié)果顯示，楓楊葉醇提取物 MIC 為 125mg·L-1，MBC 為 1 600mg·L-1；鹽酸四環(huán)素與氨芐青霉素鈉的MIC均＜2mg·L-1，MBC分別為 2～4mg·L-1和 12.5mg·L-1。見表 1。由于楓楊葉醇提取物對金黃色葡萄球菌的抑制效果優(yōu)于水提取物，故后續(xù)研究選用醇提取物。

2.2 楓楊葉醇提取物對金黃色葡萄球菌生長的影響 空白對照組金黃色葡萄球菌培養(yǎng)2h后進(jìn)入對數(shù)生長期，隨著時間的推移，細(xì)菌數(shù)量顯著增加；與空白對照組比較，各楓楊葉醇提取物處理組細(xì)菌進(jìn)入對數(shù)生長期的時間延遲，培養(yǎng)至2h時各組OD600值均低于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。培養(yǎng)至4h開始，2×MIC處理組OD600值均低于1×MIC處理組，4×MIC處理組均低于2×MIC和1×MIC處理組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。培養(yǎng)12h后，不同濃度楓楊葉醇提取物處理組菌量較空白對照組明顯減少（P＜0.01），且均進(jìn)入穩(wěn)定期；而空白對照組菌量在24h時仍呈增長趨勢。說明楓楊葉醇提取物可以明顯抑制金黃色葡萄球菌的增殖，而且抑制作用存在量效關(guān)系。見圖1。

表1 各組抑菌圈與MIC、MBC比較(±s）Tab.1 Comparison of bacteriostatic diameter and MIC,MBC in each group(±s)

表1 各組抑菌圈與MIC、MBC比較(±s）Tab.1 Comparison of bacteriostatic diameter and MIC,MBC in each group(±s)

注：每個樣本重復(fù)3次；（-）表示沒有檢測Note:Each treatment repeated three times;(-)represented no tested

指標(biāo) 水提取物 醇提取物 鹽酸四環(huán)素 氨芐青霉素鈉抑菌圈直徑（mm）MIC(mg·L-1)MBC(mg·L-1)13.94±0.23＜2 12.5 0 - -9.34±0.46 125 1 600 14.85±0.14＜2 2～4

2.3 各組金黃色葡萄球菌菌體顯微形態(tài)的觀察 掃描電鏡觀察顯示，空白對照組金黃色葡萄球菌菌體飽滿，形態(tài)完整。而楓楊葉醇提取物處理24h后，大部分菌體變形、塌陷，甚至發(fā)生表面溶解，形態(tài)完整性遭到了明顯破壞。由此說明，楓楊葉醇提取物對金黃色葡萄球菌菌體結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的破壞作用。見圖2。

圖1 楓楊葉醇提取物對金黃色葡萄球菌增殖的影響Fig.1 Effect of P.stenoptera leaves alcohol extract on the growth of S.aureus

2.4 楓楊葉醇提取物對金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜完整性的影響 SYTO9能夠穿透完整的細(xì)胞膜，與核酸結(jié)合并呈現(xiàn)強(qiáng)烈的綠色熒光，而PI進(jìn)入膜受損的細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色熒光，SYTO9和PI共存時則會出現(xiàn)黃色熒光，提示細(xì)胞膜破壞程度較輕[13]。空白對照組0.5h時可見大面積綠色熒光，說明空白對照組金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜未發(fā)生明顯損傷。處理24h后，紅色熒光略有增加，但綠色熒光仍明顯強(qiáng)于紅色，與0.5h空白對照組比較，RatioG/R差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明隨著處理時間的增加，空白對照組中僅有少部分細(xì)菌死亡。

圖2 金黃色葡萄球菌場發(fā)射掃描電鏡照片（22 000×）Fig.2 Field emission scanning electron microscope of S.aureus(22 000×)

1×MIC楓楊葉醇提取物處理0.5h后，與同時期空白對照組比較，紅色熒光增加，綠色熒光仍強(qiáng)于紅色，說明菌體細(xì)胞膜未出現(xiàn)明顯損傷，RatioG/R差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。處理24h后則出現(xiàn)黃色熒光，與24h空白對照組比較，RatioG/R差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明菌體細(xì)胞膜發(fā)生損傷。4×MIC 楓楊葉醇提取物處理0.5h，黃色熒光顏色加深同時出現(xiàn)更多的紅色熒光，與0.5h空白對照組比較，RatioG/R差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明更多的菌體細(xì)胞膜發(fā)生損傷。處理24h后，菌體細(xì)胞幾乎完全死亡，與24h空白對照組比較，RatioG/R差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明發(fā)生廣泛的細(xì)胞膜損傷。見表2、圖3。

2.5 楓楊葉醇提取物對金黃色葡萄球菌基因組DNA的影響 與空白對照組比較，2×MIC、4×MIC楓楊葉醇提取物作用后，金黃色葡萄球菌基因組DNA電泳條帶變暗，可能由于楓楊葉醇提取物與DNA結(jié)合，從而競爭性抑制了核酸染料與DNA的結(jié)合，使DNA的電泳條帶變暗；而電泳遷移增加，說明基因組DNA片段化明顯，對基因組DNA造成的損傷也更嚴(yán)重。見圖4。

表2 各組SYTO9與PI染色熒光強(qiáng)度比較（±s）Tab.2 Comparson of fluorescence intensity ratio of SYTO9 and PI staining in each group(±s)

表2 各組SYTO9與PI染色熒光強(qiáng)度比較（±s）Tab.2 Comparson of fluorescence intensity ratio of SYTO9 and PI staining in each group(±s)

注：與同時期空白對照組比較，**P＜0.01Note:Compared with blank control group of the same period,**P＜0.01

組別1×MIC處理組4×MIC處理組空白對照組RatioG/R 0.5h 24h 3.13±0.14 2.05±0.08**3.35±0.11 2.36±0.07**0.44±0.03**3.25±0.11

圖3 各組金黃色葡萄球菌熒光顯微照片（200×）Fig.3 Epifluorescence micrograph of S.aureus in each group(200×)

3 討論

金黃色葡萄球菌是一種高致病性革蘭陽性球菌，能夠引起全身及局部化膿性感染，是肺炎、心包炎、腸炎、金黃色葡萄球菌敗血癥等感染性疾病的重要病原體[14]。研究已證實楓楊的各部位均具有廣譜抗菌作用，且楓楊葉來源方便、價格低廉，因此深入研究開發(fā)相關(guān)的植物源性抗菌劑具有較高的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。近年來，楓楊抗微生物活性研究屢見報道，但大多集中于抑菌效果研究，而對相關(guān)作用機(jī)制的研究相對較少。本研究以金黃色葡萄球菌為對象，探討了楓楊葉不同溶劑提取物的抗菌活性以及相關(guān)的作用機(jī)制。

圖4 楓楊葉醇提取物對金黃色葡萄球菌基因組DNA的影響Fig.4 Effect of P.stenoptera leaves alcohol extract on genomic DNA of S.aureus

文獻(xiàn)報道，楓楊屬植物含有醌類、萜類、甾體、黃酮類等成分[15]，其中萘醌類是發(fā)揮抑菌作用的主要成分[16]。萘醌類含有苯環(huán)，分子量較大，大多具有非極性官能團(tuán)，在乙醇中溶解度更好，這是醇提取物具有較高抑菌活性的基礎(chǔ)。本實驗也證實，楓楊葉醇提取物較水提取物能更好地抑制金黃色葡萄球菌的增殖，這與潘為高等[2]的實驗結(jié)果一致。楓楊葉醇提取物抑菌活性更高，故后續(xù)選用醇提取物繼續(xù)研究，結(jié)果表明，楓楊葉醇提取物 MIC 為 125mg·L-1，MBC＞1 600mg·L-1。陽性對照藥鹽酸四環(huán)素與氨芐青霉素的MIC均小于2mg·L-1，鹽酸四環(huán)素 MBC 為 2～4mg·L-1，氨芐青霉素MBC為12.5mg·L-1，提示楓楊葉醇提取物同四環(huán)素、氨芐青霉素均能有效抑制金黃色葡萄球菌的增殖，而且其效果具有劑量和時間依賴性。

細(xì)菌主要由細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和核糖體等組成，其中細(xì)胞膜是細(xì)菌與外界進(jìn)行物質(zhì)能量交換的重要媒介[17]。藥物的抑菌作用主要通過破壞細(xì)菌細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的完整性、抑制蛋白和核酸合成等方面來實現(xiàn)[18]。青霉素結(jié)合蛋白是位于細(xì)菌胞質(zhì)膜上的蛋白質(zhì)，大分子量的青霉素結(jié)合蛋白具有轉(zhuǎn)肽酶及轉(zhuǎn)糖基酶活性，參與細(xì)菌細(xì)胞壁的合成；小分子量則具有羧肽酶活性，與細(xì)菌分裂有關(guān)。β-內(nèi)酰胺類抗生素如氨芐青霉素主要作用于菌體內(nèi)的青霉素結(jié)合蛋白,抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成，使菌體失去滲透屏障而膨脹、裂解[19]。四環(huán)素類能增加細(xì)菌細(xì)胞膜通透性，與細(xì)菌胞內(nèi)核糖體30S亞基形成可逆結(jié)合體，抑制蛋白質(zhì)合成，還可通過結(jié)合線粒體70S亞基，抑制線粒體蛋白質(zhì)的合成，從而起到抗菌效果[20-21]。由于抗生素長期廣泛用于治療人及動物的細(xì)菌感染，導(dǎo)致不斷出現(xiàn)耐藥菌株。植物源性抗菌劑異于傳統(tǒng)抗菌劑的抗菌機(jī)制，已成為近年來的研究熱點。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，楓楊葉醇提取物處理24h后，大部分菌體變形，塌陷，甚至發(fā)生表面溶解等現(xiàn)象，形態(tài)完整性遭到了破壞。熒光染色結(jié)果表明楓楊葉醇提取物對金黃色葡萄球菌的抑制效應(yīng)可能是通過破壞菌體細(xì)胞膜的完整性而實現(xiàn)的，這與本實驗中掃描電鏡觀察結(jié)果一致。

DNA是生物體儲存、復(fù)制和傳遞遺傳信息的物質(zhì)基礎(chǔ)，在遺傳信息傳遞、物質(zhì)合成、生長發(fā)育等生物過程中起關(guān)鍵性作用?？咕幬锶襞c菌體DNA作用，會干擾菌體遺傳指令的傳遞，影響與新陳代謝相關(guān)的物質(zhì)合成，從而起到抑菌作用[22]?；蚪MDNA片段化是細(xì)菌衰亡的標(biāo)志，若發(fā)生DNA裂解，說明細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生凋亡。許多中藥成分通過裂解細(xì)菌DNA實現(xiàn)抗菌活性。Anandhi等[23]發(fā)現(xiàn)，卷果云實甙和黃酮類化合物處理24h后，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌均表現(xiàn)出明顯的DNA裂解；Ahsan等[24]和Ya－dav等[25]研究發(fā)現(xiàn)，烏墨葉和種子提取物能損傷枯草芽孢桿菌基因組DNA，從而表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性。還有研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖通過裂解菌體DNA從而抑制金黃色葡萄球菌的增殖[26]。本實驗中瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，楓楊葉醇提取物與金黃色葡萄球菌DNA結(jié)合，損傷甚至裂解DNA，從而達(dá)到抑菌效果。

綜上所述，楓楊葉醇提取物能顯著抑制金黃色葡萄球菌的增殖，其 MIC 為 125mg·L-1，MBC＞1 600mg·L-1。抑菌機(jī)制研究結(jié)果表明，楓楊葉醇提取物能破壞金黃色葡萄球菌菌體形態(tài)，使之發(fā)生變形、塌陷，甚至表面溶解；增加細(xì)胞膜通透性，造成細(xì)菌生理功能紊亂；同時損傷甚至裂解細(xì)菌DNA，從而發(fā)揮抑菌作用。然而楓楊葉醇提取物對細(xì)菌作用是否還有其他機(jī)制參與如抑制蛋白合成、破壞細(xì)胞壁等還需要進(jìn)一步研究。