邵遠(yuǎn)洋，彭 蓮，俞越童，曹光昭，鄒慧琴＊＊，閆永紅＊＊

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100102；2. 中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 廣州 510630）

喜馬拉雅紫茉莉（Mirabilis himalaica(Edgew.)Heim.）始載于藏醫(yī)藥學(xué)《月王藥診》，分布于我國西藏、甘肅和青海等地區(qū)；《中國植物志》描述喜馬拉雅紫茉莉?qū)儆谏阶宪岳?，?年或多年生草本；其入藥部位是干燥的根，有溫胃、暖腎、生肌、排石、利尿等功效，可用于治療腰、下腹、關(guān)節(jié)痛及下半身寒等癥[1]；藏醫(yī)記載，喜馬拉雅紫茉莉是藏藥五根藥的上品[2,3]，其在藏醫(yī)藥的應(yīng)用中歷史悠久。

高效液相色譜技術(shù)具有靈敏度高、效率高等優(yōu)點(diǎn)，主要應(yīng)用于大多數(shù)的非揮發(fā)、熱不穩(wěn)定的化合物的研究，在民族藥的研究中是應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一[4,5]。中藥指紋圖譜：中藥材經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)示該中藥材特性的共有峰的圖譜[6]。HPLC 指紋圖譜可以實(shí)現(xiàn)中藥材的定性、定量評(píng)價(jià)，協(xié)助完成藥材的產(chǎn)地、物種的判別[7,8]。胡春月等運(yùn)用HPLC 指紋圖譜技術(shù)對(duì)禹州漏蘆正丁醇部位進(jìn)行研究，為禹州漏蘆保肝活性的研究及臨床應(yīng)用提供一定的參考[9]；李嫻等對(duì)熟地黃制炭前后的化學(xué)成分進(jìn)行HPLC 指紋圖譜的研究[10]；鄭孟凱等運(yùn)用HPLC 指紋圖譜技術(shù)客觀、有效的評(píng)價(jià)了不同產(chǎn)區(qū)的市售麻黃的質(zhì)量[11]；楊秀娟等運(yùn)用HPLC 指紋圖譜技術(shù)研究甘肅不同產(chǎn)區(qū)的紅芪[12]，為甘肅產(chǎn)區(qū)紅芪的質(zhì)量評(píng)價(jià)及產(chǎn)地鑒別提供了有價(jià)值的參考；寧德生等[13]運(yùn)用HPLC 指紋圖譜對(duì)地楓皮進(jìn)行相關(guān)研究，完善了地楓皮真?zhèn)蔚蔫b別及質(zhì)量的控制標(biāo)準(zhǔn)；閆偉偉等[14]運(yùn)用HPLC 指紋圖譜技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地的杏花進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的杏花質(zhì)量存在差異。HPLC 指紋圖譜技術(shù)在研究中藥化學(xué)成分中具有整體性和唯一性的特征，在中藥種類、產(chǎn)地以及真?zhèn)蔚蔫b別過程中廣泛應(yīng)用，隨著現(xiàn)代分析手段的不斷發(fā)展，HPLC 指紋圖譜技術(shù)將在中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善方面發(fā)揮重要作用。

喜馬拉雅紫茉莉主要分布于我國西藏、甘肅和青海等地區(qū)，隨著人們對(duì)喜馬拉雅紫茉莉的不斷采挖，其野生資源日趨枯竭。2006 年，旦智草等[15]首次完成了對(duì)喜馬拉雅紫茉莉人工馴化栽培試驗(yàn)。近年來，關(guān)于喜馬拉雅紫茉莉的栽培技術(shù)逐步成熟，但是關(guān)于不同產(chǎn)區(qū)及不同生長方式的喜馬拉雅紫茉莉的質(zhì)量的研究少見報(bào)道，評(píng)價(jià)其質(zhì)量的實(shí)踐工作中更是無標(biāo)準(zhǔn)可依。中藥指紋圖譜在闡釋中藥復(fù)雜成分與其質(zhì)量關(guān)系的過程中扮演著重要的角色，在闡釋過程中，相似度評(píng)價(jià)發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。本研究運(yùn)用HPLC 指紋圖譜技術(shù)并結(jié)合相似度評(píng)價(jià)、主成分分析等手段，對(duì)不同產(chǎn)區(qū)、不同生長方式喜馬拉雅紫茉莉的質(zhì)量進(jìn)行研究，為全面系統(tǒng)的分析喜馬拉雅紫茉莉的品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

島津液相LC-20A（島津企業(yè)管理（中國）有限公司），四元泵，DAD 檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器；ZORBAX Extend-C18 色譜柱（4.6 × 250 mm，5 μm）；0.45 μm 針筒式微孔濾膜過濾器；BP 211D 型電子天平（十萬分之一，德國賽多利斯）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（500 W，40 KHz，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

收集甘肅、西藏、拉薩不同產(chǎn)區(qū)的喜馬拉雅紫茉莉，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)閆永紅教授鑒定為喜馬拉雅紫茉莉（Mirabilis himalaica(Edgew.) Heim.）干燥根（表1）。色譜純乙腈、分析純甲醇、Mirabijalone A、Boeravinone C、 Mirabijalone I、 Mirabijalone H、Abronione 和Boeravinone F均為實(shí)驗(yàn)室自制。

表1 不同產(chǎn)區(qū)、不同生長方式的喜馬拉雅紫茉莉樣品信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 供試液提取溶劑的選擇

提取溶劑在一定程度上影響著有效成分峰的數(shù)目、峰形的好壞以及基線是否平穩(wěn)。同一條件下，平行精密稱取同一批次喜馬拉雅紫茉莉根干燥粉末0.500 g 置于50 mL三角瓶中，依次加入10 mL甲醇、乙醇和乙酸乙酯，同樣條件下，超聲提取40 min，靜置至室溫，過濾并補(bǔ)足溶劑至10 mL，混勻后，0.45 μm 有機(jī)濾膜過濾1 mL 至液相小瓶，獲取續(xù)濾液，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。結(jié)果表明，選擇甲醇作為提取溶劑時(shí)，有效成分峰數(shù)目多、峰形好且基線平穩(wěn)，因此本研究選擇甲醇作為提取溶劑（圖1a）。

2.2 洗脫條件的選擇

洗脫條件在成分峰分離、拖尾、重疊及基線平穩(wěn)方面發(fā)揮著重要的作用。本研究選取乙腈（B），水（A）為流動(dòng)相，其余條件均保持一致，在系統(tǒng)1、2、3、4條件下進(jìn)行梯度洗脫。系統(tǒng)1：（0-20 min，5%-30%B；20-40 min，30%-80%B；40-50 min，80-95%B）系統(tǒng)2：（0-5 min，5%-5%B；5-15 min，5%-20%B；15-40 min，20%-95%B）系統(tǒng)3：（0-10 min，5%-30%B；10-40 min，30%-80%B；40-42 min，80%-95%B）系 統(tǒng)4：（0-10 min，5%-20%B；10-40 min，20%-80%B；40-42 min，80%-95%B）。結(jié)果顯示，系統(tǒng)4 條件下，喜馬拉雅紫茉莉有效成分間分離良好，沒有出現(xiàn)拖尾及重疊現(xiàn)象，并且基線平穩(wěn)。故選擇系統(tǒng)4 作為洗脫條件（圖1b）。

2.3 檢測(cè)波長的選擇

檢測(cè)波長在一定程度上影響有效成分峰數(shù)目的多少、分離效果的好壞及基線是否平穩(wěn)。保持其他條件相同，選擇在200-400 nm范圍內(nèi)對(duì)喜馬拉雅紫茉莉特征化學(xué)成分進(jìn)行掃描。波長為280 nm 時(shí)，化學(xué)成分出峰數(shù)目多，分離效果明顯，基線平穩(wěn)，因此選擇280 nm作為喜馬拉雅紫茉莉HPLC 指紋圖譜的檢測(cè)波長（圖1c）。

圖1 HPLC指紋圖譜

2.4 進(jìn)樣量的選擇

進(jìn)樣量的多少往往會(huì)對(duì)精密度、準(zhǔn)確度、有效成分峰數(shù)目、基線波動(dòng)情況、拖尾及重疊產(chǎn)生影響。保持其余因素不變，控制進(jìn)樣量15 μL、20 μL、25 μL，篩選最佳進(jìn)樣量。進(jìn)樣量為20 μL 時(shí)，精確度、準(zhǔn)確度高、有效成分峰數(shù)目多、基線較平穩(wěn)、拖尾及重疊少（圖1d）。因此選擇20 μL 作為喜馬拉雅紫茉莉HPLC指紋圖譜的進(jìn)樣量。

2.5 柱溫的選擇

峰形的好壞、基線是否平穩(wěn)在一定程度上取決柱溫的高低，本研究選取20℃、25℃、30℃的柱溫，其余條件保持一致，篩選最適柱溫。結(jié)果顯示，柱溫為25℃時(shí)，各個(gè)成分峰形最好，基線最平穩(wěn)（圖1e）。因此選擇25℃作為喜馬拉雅紫茉莉HPLC指紋圖譜的柱溫。

2.6 方法組學(xué)考察

2.6.1 精密度試驗(yàn)

精確稱取B 樣品0.500 g，按照篩選的最適條件制備供試品溶液，在同一色譜條件下，進(jìn)樣20 μL，連續(xù)平行進(jìn)樣6 次，記錄各個(gè)色譜峰的保留時(shí)間和峰面積以及各個(gè)峰形之間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果顯示，共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.0713%-0.2225%，相對(duì)峰面積的RSD為0.289%-1.124%，該條件下精密度良好。

2.6.2 重復(fù)性考察

精密稱取喜馬拉雅紫茉莉B 樣品，每份0.500 g，按照6.1 方法制備供試品溶液，對(duì)成分峰的峰面積及保留時(shí)間的一致性進(jìn)行考察。結(jié)果表明，共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.199 4%-0.260 3%，相對(duì)峰面積的RSD為0.095 8%-1.3720%，該條件下重復(fù)性良好。

2.6.3 穩(wěn)定性考察

精密稱取喜馬拉雅紫茉莉B 樣品0.500 g，按照同樣的方法制備樣品，在0 h，4 h，8 h，16 h，24 h，36 h 依次檢測(cè)供試品溶液。結(jié)果顯示，共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.074 2%-0.1350%，相對(duì)峰面積的RSD為0.0709%-1.8970%，表明樣品在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 指紋圖譜建立及技術(shù)參數(shù)

2.7.1 喜馬拉雅紫茉莉指紋圖譜的建立

按照上述最適條件分析所搜集的19 批喜馬拉雅紫茉莉藥材，獲得19 批喜馬拉雅紫茉莉藥材的HPLC指紋圖譜（圖2）。將19 批喜馬拉雅紫茉莉藥材的HPLC 數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004）A 版”進(jìn)行藥材對(duì)照指紋圖譜及共有模式的生成，共確定9個(gè)共有成分。

2.7.2 特征指紋峰的標(biāo)定

分析19 批喜馬拉雅紫茉莉HPLC 檢測(cè)結(jié)果，依據(jù)保留時(shí)間對(duì)特征峰進(jìn)行標(biāo)定，結(jié)果顯示在19批喜馬拉雅紫茉莉HPLC 色譜結(jié)果中存在9 個(gè)共有峰（圖3）。核對(duì)對(duì)照品，確定4 號(hào)峰是Boeravinone C，5 號(hào)峰是Boeravinone F，6 號(hào)峰是Mirabijalone A，7 號(hào)峰是Mirabijalone I，8 號(hào)峰是 Abronione，9 號(hào)峰是Mirabijalone H，其中，9 個(gè)化合物的保留時(shí)間及峰面積（表2，表3）。

圖2 19 批喜馬拉雅紫茉莉HPLC指紋圖譜

圖3 喜馬拉雅紫茉莉?qū)φ罩讣y圖譜

表2 19批喜馬拉雅紫茉莉樣品共有峰保留時(shí)間

表3 19批喜馬拉雅紫茉莉樣品共有峰保留面積

2.7.3 喜馬拉雅紫茉莉指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

通過HPLC 指紋圖譜可獲取樣品的整體信息，分析對(duì)比圖譜，得到不同樣品間的相似度[16,17]。借助于該技術(shù)可完成對(duì)指紋圖譜全面、客觀的評(píng)價(jià)。運(yùn)用國家藥典委員會(huì)2004年頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A 版”，對(duì)19 批喜馬拉雅紫茉莉指紋圖譜相似度進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，有17個(gè)樣本的相似度在0.90 以上，該結(jié)果表明，不同產(chǎn)地、不同生長方式的指紋圖譜也具有非常高的相似度（表4）。

表4 19 批喜馬拉雅紫茉莉相似度計(jì)算表

2.8 喜馬拉雅紫茉莉指紋圖譜的主成分分析（PCA）

為了進(jìn)一步分析不同產(chǎn)區(qū)、不同生長方式的喜馬拉雅紫茉莉品質(zhì)差異，本研究對(duì)19批喜馬拉雅紫茉莉HPLC 指紋圖譜共有成分的相對(duì)含量進(jìn)行PCA 分析（圖4）。結(jié)果顯示，在PCA圖中，19批喜馬拉雅紫茉莉的野生品和栽培品分布于圖的左右兩側(cè)。該結(jié)果表明，喜馬拉雅紫茉莉的特征性成分的差異與其生長方式存在一定的相關(guān)性。

3 討論

本研究在喜馬拉雅紫茉莉HPLC 指紋圖譜建立的過程中，對(duì)提取溶劑、洗脫條件、檢測(cè)波長、進(jìn)樣量、柱溫均做了篩選，綜合特征峰的數(shù)目、形狀、特征峰之間的分離效果、基線的平穩(wěn)性、準(zhǔn)確度、精密度以及拖尾、重疊等因素，最終篩選得到提取溶劑甲醇，系統(tǒng)4，檢測(cè)波長280 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫25℃。該條件下喜馬拉雅紫茉莉中特征性成分，分離好，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性強(qiáng)。

圖4 19批喜馬拉雅紫茉莉特征性成分的PCA分析

本研究基于HPLC 指紋圖譜并結(jié)合相似度分析軟件和主成分分析方法，明確了喜馬拉雅紫茉莉指紋圖譜的特征，歸屬了HPLC 指紋圖譜中的主要指紋峰。分析表明，不同產(chǎn)區(qū)、不同生長方式的喜馬拉雅紫茉莉共有峰相似度較高，不同生長方式的喜馬拉雅紫茉莉特征性成分含量差異明顯。

應(yīng)用HPLC 指紋圖譜能夠?qū)崿F(xiàn)中藥較為全面、綜合的質(zhì)量控制和質(zhì)量評(píng)價(jià)，本研究建立了不同產(chǎn)地、不同生長方式的喜馬拉雅紫茉莉特征HPLC 指紋圖譜，在一定程度上彌補(bǔ)了喜馬拉雅紫茉莉品質(zhì)評(píng)價(jià)的不足，完善了該藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，為該藥的更全面、綜合的質(zhì)量控制和品質(zhì)評(píng)價(jià)提供重要參考。