陸林玉，吳 蝶，王 凱，唐娟娟＊＊，陳 剛

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院·整合醫(yī)學(xué)學(xué)院 南京 210023；2. 暨南大學(xué)腦病個性化防治跨學(xué)科研究所 廣州 510632；3. 神經(jīng)再生協(xié)同創(chuàng)新中心 南通 226001）

抑郁癥是一種以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征的情感性精神障礙綜合征，因其具有高患病率和高致死率，被稱為“第一心理殺手”。目前臨床首選抗抑郁藥物為5-羥色胺再攝取抑制劑，如氟西汀、舍曲林和帕羅西汀等[1]。然而，這些藥物作用大部分基于單胺類神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)的假說，且存在副作用大、起效慢和易復(fù)發(fā)等缺點，這表明單胺類神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)假說并不能完全闡明抑郁癥的發(fā)病機制。因此，探討抑郁癥發(fā)病機制，尋找快速起效安全的抗抑郁藥迫在眉睫。

近年來的研究證實，自噬參與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展。自噬是細胞自我降解的過程，通過去除錯誤折疊或聚集的蛋白以及損傷的細胞器減少細胞的壞死和凋亡，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。自噬在一定限度內(nèi)是有益的反應(yīng)，但是在一些疾病過程中，可能出現(xiàn)自噬過度激活的現(xiàn)象。Beclin-1 與LC3 是兩種具有代表性的自噬標志性蛋白，Beclin-1是調(diào)控細胞自噬的關(guān)鍵因子，是自噬體形成的必要條件，LC3 則參與自噬體膜的形成[2]。重度抑郁癥患者血液中自噬基因表達增加，產(chǎn)前應(yīng)激小鼠的雄性后代海馬自噬水平升高[3]。抑郁癥患者尸檢發(fā)現(xiàn)，前額葉皮層(prefrontal cortex，PFC)突觸蛋白合成受抑制，mTOR 磷酸化水平降低，提示自噬激活[4]。mTOR 是自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其絲氨酸2448位點磷酸化后可被激活，繼而磷酸化下游底物，調(diào)控自噬相關(guān)蛋白。mTOR 通路的異常往往伴隨著自噬障礙。雙相情感障礙患者AKT（Protein kinase B，PKB）和mTOR 的mRNA 表達較健康對照組顯著降低，可能導(dǎo)致自噬的誘導(dǎo)[5]?？焖倨鹦г退幝劝吠軌蛲ㄟ^激活mTOR，抑制自噬，增強突觸可塑性，從而發(fā)揮快速抗抑郁作用[6]。

越鞠丸始載于《丹溪心法》，由梔子、蒼術(shù)、香附、川芎、神曲組成，是治療郁癥的經(jīng)典方，對其治療抑郁癥的相關(guān)機制研究也多見報道[7-9]。本實驗室前期研究結(jié)果表明，在小鼠慢性不可預(yù)知應(yīng)激模型中，越鞠丸醇提物（YJ-E）具有快速持久的抗抑郁作用，其作用靶點為mTOR 信號通路[7]，但是越鞠丸與mTOR 調(diào)控的自噬相關(guān)性尚不清楚。本實驗旨在皮質(zhì)酮離體應(yīng)激模型的基礎(chǔ)上，評價YJ-E 對PC12 細胞的神經(jīng)保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑

越鞠丸由梔子、川芎、蒼術(shù)、香附、神曲組成，藥材來自南京國醫(yī)堂門診部藥房，皮質(zhì)酮（CORT）購自

Aladdin，C104537。

胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），胰蛋白酶（trypsin，Gibco，10270-106，25200-056）；高糖培養(yǎng)基（Dulbecco's modification of Eagle's medium，DMEM，

Gibco，11995-065）；MTT（Biofrox，298-93-1）；青霉素-鏈 霉 素（Gibco）；磷 酸 鹽緩 沖 液（phosphate buffer saline，PBS，Hyclone，SH30256.01）；二 甲 基 亞 砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO，Aladdin，D103272）。

1.2 儀器

SC06AD-2 型恒溫二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱；CX31型熒光倒置顯微鏡（Olympus）；Multiskan FC 型全自動酶標比色儀（Thermo Scientific）；ThermoFisher50137369低溫超速離心機，EPED-E2-10TF 型超純水器，SWCJ-2F 型雙人雙面超凈臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；TY-80S 型脫色搖床（普陽科學(xué)儀器研究所）；蛋白電泳系統(tǒng)，Mini Trans-Blot 轉(zhuǎn)印槽（Bio-Rad）；5200 系列凝膠成像及分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司），Thermo Nanodrop 2000紫外分光光度計。

1.3 細胞培養(yǎng)

PC12 細胞復(fù)蘇后培養(yǎng)（10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素）于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，24 h 后更換培養(yǎng)基，取對數(shù)生長期的PC12細胞，以5×104個·mL-1的密度，接種于96孔培養(yǎng)板，待細胞完全貼壁后，加入皮質(zhì)酮濃度梯度為100，200，400 μmol·L-1，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4 越鞠丸醇提液（YJ-E）的制備

梔子、蒼術(shù)、香附、川芎、神曲各200 g 打粉，過100目篩混勻，加入10 倍量95%乙醇室溫24 h，收集浸出液，重復(fù)2 次。過濾浸出液后，55℃條件下減壓濃縮，收集濃縮后浸膏48.4 g，分裝于-20℃保存。將越鞠丸母液（48.4 g·L-1）用DMEM 分別稀釋為0.2，0.4，0.8 mg·mL-1，預(yù)給藥30 min 后，皮質(zhì)酮(200 μmol·L-1)孵育24 h，更換不含血清高糖DMEM 培養(yǎng)液，進行后續(xù)實驗。

1.5 MTT法測定細胞存活率

PC12 細胞接種于96 孔板上培養(yǎng)24 h 后更換無血清培養(yǎng)基，隨機分組。YJ-E 預(yù)給藥30min，皮質(zhì)酮孵育24 h，每孔加入20 μL 5 g·L-1的MTT 溶液，37℃繼續(xù)孵育4 h，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，搖床慢搖20 min，570 nm 波長測定各孔光吸收值，并記錄結(jié)果。

1.6 Hoechst 染色法

PC12細胞接種于24孔板（2×105mL-1），培養(yǎng)24 h后更換無血清培養(yǎng)基，隨機分組。YJ-E 預(yù)給藥30 min后，皮質(zhì)酮孵育24 h，吸棄培養(yǎng)基，加入終濃度10 μg·mL-1的Hoechst 33342 溶 液（四正柏，F(xiàn)XP138-1000）250 μL，室溫放置15-60 min 后，吸棄染色液，4%多聚甲醛溶液固定20 min。PBS 溶液洗滌細胞3 次，每次10 min。熒光顯微鏡紫外濾光器下觀察細胞核大小及形態(tài)。

1.7 Western blotting

PC12 細胞接種于6 孔板（1 × 106mL-1，2 mL/孔），24 h 更換無血清培養(yǎng)基，隨機分組。YJ-E 孵育30 min后加入皮質(zhì)酮，24 h 后收集細胞，加入50 μL RIPA（Radio-Immunoprecipitation Assay）裂解液，離心取上清，紫外分光光度計測定蛋白濃度。10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，300 mA 轉(zhuǎn)膜（Polyvinylidene fluoride，PVDF膜）60 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗p-mTOR，mTOR，LC3，Beclin-1 （Cell Signaling Technology，2972S，2971S，4108，3738），Tubulin（proteintech，10094-1-AP）4℃過夜。TBST 漂洗3 次，10 min·次-1，加入二抗羊抗兔-HRP（正能，511203）37℃孵育1 h，TBST 漂洗3 次，10 min·次-1，ECL 顯影（康為世紀生物科技），全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)顯影分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)均用±SEM 表示，采用One-way ANOVA 結(jié)合Tukey 多重比較（GraphPad Prism 5.0）分析各組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 0.4 mg·mL-1 YJ-E提高皮質(zhì)酮模型下PC12細胞的存活率。a.3個濃度的皮質(zhì)酮（100,200,400 μmol·L-1）均能顯著降低PC12細胞的活性。ANOVA,F（3,33）=20.36,P＜0.0001；b.預(yù)給予3個濃度YJ-E（0.2，0.4，0.8 mg·mL-1），其后給予皮質(zhì)酮200 μmol·L-1,其中0.4 mg·mL-1 YJ-E顯著改善皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細胞的凋亡，0.2，0.8 mg·mL-1YJ-E不能逆轉(zhuǎn)PC12細胞的凋亡。ANOVA,F（5,37）=11.06,P＜0.0001；c.Hoechst染色。*P＜0.05，**P＜0.01，與對照組相比，##P＜0.01，與皮質(zhì)酮組相比，n=5。

2 結(jié)果與分析

2.1 YJ-E改善皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細胞的凋亡

MTT法結(jié)果顯示，給予100 μmol·L-1皮質(zhì)酮，PC12細胞存活率為82.4%；給予200 μmol·L-1皮質(zhì)酮，細胞存活率為74.1%；給予400 μmol·L-1皮質(zhì)酮，細胞存活率為62.5%，三個濃度的皮質(zhì)酮均能顯著降低PC12 細胞的活力（ANOVA, F（3, 33）=20.36,P＜0.0001）（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）（圖1a），因此選取200 μmol·L-1進行后續(xù)實驗。結(jié)果表明，皮質(zhì)酮濃度依賴性的損傷PC12細胞。

預(yù)給予3 個濃度的YJ-E（0.2，0.4，0.8 mg·mL-1），其中0.4 mg·mL-1的YJ-E 能夠顯著改善皮質(zhì)酮模型下PC12 細胞的存活（P＜0.01），0.2，0.8 mg·mL-1的YJ-E均無顯著改善作用。單獨給予0.8 mg·mL-1的YJ-E 對PC12 細胞的存活率無顯著影響（ANOVA, F（5,37）=11.06，P＜0.0001）（圖1b）。因此選取0.4 mg·mL-1YJE進行后續(xù)實驗。

Hoechst 染色結(jié)果顯示，對照組和單獨給予YJ-E組PC12 細胞核形態(tài)呈圓形，淡藍色，內(nèi)有較深藍色顆粒。皮質(zhì)酮模型組大部分細胞核濃集呈亮藍色，形態(tài)皺縮。預(yù)給予YJ-E 組大部分細胞核呈圓形淡藍色，僅少量細胞核皺縮（圖1c）。結(jié)果表明，0.4 mg·mL-1YJ-E 顯著改善皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12 細胞凋亡，而0.2，0.8 mg·mL-1的YJ-E無此神經(jīng)保護作用。

2.2 YJ-E抑制皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細胞的過度自噬

Western blotting 結(jié)果顯示，200 μmol·L-1皮質(zhì)酮顯著降低mTOR 的磷酸化（P＜0.01），預(yù)給予0.4 mg·mL-1YJ-E 逆轉(zhuǎn)了mTOR 磷酸化水平的降低（P＜0.01）（ANOVA,F（3,8）=11.9，P=0.0026）。同時，皮質(zhì)酮模型下LC3II/LC3I 和Beclin 的表達增加（P＜0.01,P＜0.01），YJ-E 抑制了LC3II/LC3I 和Beclin 的蛋白表達（P＜0.01，P＜0.05）（ANOVA, F（3,8）= 9.788,P=0.0047；ANOVA，F(xiàn)（3,8）=9.194，P=0.0057）。單獨給予YJ-E 對于mTOR 的磷酸化及LC3II/LC3I，Beclin 的蛋白表達水平無影響（圖2）。結(jié)果表明，YJ-E 對皮質(zhì)酮離體模型下PC12 細胞的神經(jīng)保護作用機制可能與促進mTOR磷酸化，抑制神經(jīng)元過度自噬相關(guān)。

圖2 YJ-E促進皮質(zhì)酮離體模型下PC12細胞mTOR的磷酸化，抑制神經(jīng)元過度自噬。a.Western blotting結(jié)果圖示p-mTOR，mTOR,LC3I,LC3II，Beclin和Tubulin的表達；b-d.預(yù)給予0.4 mg·mL-1YJ-E，其后給予200 μmol·L-1皮質(zhì)酮,對PC12細胞mTOR磷酸化水平及LC3，Beclin表達的影響。ANOVA,F（3,8）=11.9,P=0.0026；ANOVA,F（3,8）=9.788,P=0.0047；ANOVA,F（3,8）=9.194,P=0.0057。**P＜0.01，與對照組相比，##P＜0.01，與皮質(zhì)酮組相比，n=3。

3 討論

抑郁癥與中醫(yī)的“郁證”類似，一些解郁的經(jīng)方已廣泛用于治療抑郁癥，如甘麥大棗湯，梔子厚樸湯，越鞠丸等。本實驗室前期對越鞠丸的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠慢性不可預(yù)知應(yīng)激模型（Chronic unpredictable mild stress，CUMS）中，越鞠丸表現(xiàn)出與氯胺酮類似的快速抗抑郁作用，其作用靶點為NR1（N-methyl-Daspartic acid receptor 1，NMDA 受體1）和Akt/mTOR 信號通路[7]；在慢性注射皮質(zhì)酮的小鼠抑郁癥模型中，越鞠丸可以激活PKA（protein kinase A，蛋白激酶A）-ERK（extracellular regulated protein kinases，細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶）-CREB（cAMP response element binding protein，cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白）信號通路，增強海馬神經(jīng)新生，發(fā)揮抗抑郁作用[10]。越鞠丸加四君子湯能夠快速增加小鼠海馬中的PACAP 和BDNF 蛋白的表達而產(chǎn)生快速抗抑郁的作用[11]。越鞠丸還可以通過增加Balb/c 小鼠前額皮層的場電位及長時程增強，提高突觸傳遞效能，產(chǎn)生抗抑郁作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)：①高濃度皮質(zhì)酮顯著損傷PC12 細胞，降低其活力，因此本研究在體外模型中模擬了抑郁癥形成過程中皮質(zhì)酮對神經(jīng)細胞活力的損傷作用；②0.4 mg·mL-1YJ-E能夠改善皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12 細胞凋亡，而低、高劑量均無此神經(jīng)保護作用；③YJ-E 顯著增加皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12 細胞mTOR 的磷酸化水平，與CUMS 小鼠模型YJ-E 對前額葉神經(jīng)細胞的作用相一致；④YJ-E 顯著抑制皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12 細胞自噬相關(guān)蛋白LC3II/LC3I 和Beclin 的表達，顯示YJ-E 能夠逆轉(zhuǎn)此離體模型中神經(jīng)細胞的過度自噬。

慢性應(yīng)激能夠引起人類和小鼠糖皮質(zhì)激素和皮質(zhì)酮水平升高，而過高的糖皮質(zhì)激素和皮質(zhì)酮也是抑郁癥的重要表現(xiàn)之一。高濃度的糖皮質(zhì)激素和皮質(zhì)酮能誘發(fā)神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞相關(guān)的多種疾病反應(yīng)，如調(diào)亡、自噬和突觸可塑性的改變。因此離體實驗通常采用皮質(zhì)酮刺激神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞，模擬抑郁癥的內(nèi)環(huán)境，建立抑郁癥離體模型[13]。自噬是真核細胞中普遍存在的一種現(xiàn)象，在維持細胞、組織和生物體穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮重要作用。在抑郁癥相關(guān)的動物模型中，研究發(fā)現(xiàn)自噬水平降低的現(xiàn)象。例如，在LPS（Lipopolysaccharides，脂多糖）以及慢性不可預(yù)知應(yīng)激誘導(dǎo)的動物抑郁模型中，自噬標志物表達降低[14,15]。然而，臨床研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，患有嚴重抑郁癥的個體血液單核細胞中的自噬基因的表達升高[16]。所以在抑郁癥中，自噬的調(diào)節(jié)是正向還是負向尚存在爭議[17]。近期研究發(fā)現(xiàn)許多抗抑郁藥與自噬通路密切相關(guān)[18]，經(jīng)典自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素通過mTOR通路發(fā)揮抗抑郁樣作用[19]，另外金絲桃素[20]、羅格列酮[21]、水飛薊賓[22]和芡實提取物[23]等均能通過增強自噬抗抑郁。因此，自噬是一把雙刃劍。適度的自噬可以將一些損壞的蛋白或細胞器進行降解，并得以循環(huán)利用。過度的自噬會導(dǎo)致細胞內(nèi)代謝紊亂，引起神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞功能異常甚至凋亡，可能是離體皮質(zhì)酮模型中神經(jīng)細胞活力明顯下降的原因之一?？挂钟羲幏魍⊥ㄟ^上調(diào)AKT 的磷酸化促進神經(jīng)發(fā)生并改善神經(jīng)元存活，而PI3K（Phosphoinositide 3-kinase，磷脂酰肌醇三激酶）-AKT-mTOR 信號通路是抑郁癥中調(diào)節(jié)自噬的重要通路[15]。Warren 等[24]發(fā)現(xiàn)，氟西汀和派醋甲酯聯(lián)用能夠逆轉(zhuǎn)SD 大鼠的抑郁樣行為，并增加大鼠腹側(cè)被蓋區(qū)mTOR、CREB（環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白，cAMP-response element binding protein）、ERK（細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶，extracellular regulated protein kinases）的蛋白表達水平。因此，mTOR 信號通路參與抗抑郁藥的作用機制，其通過促進蛋白質(zhì)合成誘導(dǎo)神經(jīng)再生，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[25]。Park 等[26]發(fā)現(xiàn)西酞普蘭、帕羅西汀與苯環(huán)丙胺可以顯著增加mTOR 及其下游分子4E-BP1（真核翻譯起始因子4E 結(jié)合蛋白1，Eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1）和p70S6K 的磷酸化水平，并增加海馬樹突生長和突觸蛋白水平，這些作用可以被雷帕霉素所抑制。本研究中越鞠丸可以促進皮質(zhì)酮模型下PC12 細胞mTOR 的磷酸化，其通過mTOR 信號通路調(diào)控細胞自噬，保護細胞免受皮質(zhì)酮的損傷。

微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC-3）和Beclin 是自噬相關(guān)基因編碼產(chǎn)物，LC-3Ⅰ向LC-3Ⅱ轉(zhuǎn)化是判斷自噬的指標，而Beclin-1 是自噬必不可少的正向調(diào)節(jié)因子[27]。因此，本研究通過觀察mTOR 的磷酸化水平以及LC3、Beclin 自噬相關(guān)指標，發(fā)現(xiàn)：慢性應(yīng)激可以通過抑制mTOR 磷酸化誘導(dǎo)自噬。適度自噬對維持神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用，但是持續(xù)慢性應(yīng)激導(dǎo)致腦內(nèi)皮質(zhì)酮大量蓄積，誘導(dǎo)神經(jīng)元內(nèi)過度自噬，自噬小體積聚，神經(jīng)元凋亡增加，從而引發(fā)抑郁癥。越鞠丸醇提物能夠通過調(diào)控mTOR 的磷酸化阻斷神經(jīng)元內(nèi)過度自噬，減少自噬小體的形成，在離體抑郁癥模型中發(fā)揮神經(jīng)保護作用（圖3）。

圖3 假說圖：越鞠丸醇提物通過調(diào)控mTOR的磷酸化阻斷神經(jīng)元內(nèi)過度自噬，減少自噬小體的形成，在離體抑郁癥模型中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

抑郁癥是一種慢性、易復(fù)發(fā)的精神障礙疾病，近年來越發(fā)引起臨床關(guān)注。越鞠丸功用行氣解郁,臨床常用于郁證的治療。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，建立抑郁癥離體模型，探討了抑郁癥中神經(jīng)元過度自噬的可能機制，并進一步為臨床應(yīng)用越鞠丸治療抑郁癥提供了有力證據(jù)，也為研發(fā)靶向自噬抗抑郁癥藥物提供新的策略。