宋禎彥，余婧萍，賀春香，陳易璇，李富周，成紹武

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 長沙 410208）

1 前言

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是與衰老相關(guān)的致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。根據(jù)阿爾茨海默病協(xié)會(huì)2016年發(fā)布的1份報(bào)告，每33秒就會(huì)出現(xiàn)1 例AD 新病例，每年新增病例近100 萬例，預(yù)計(jì)到2050 年，該病的流行范圍將達(dá)到1100 萬到1600 萬[1]。AD 是由復(fù)雜的病因引起神經(jīng)功能障礙，其發(fā)病的分子機(jī)制尚不明確[2]。目前大多數(shù)人認(rèn)為AD 的發(fā)病過程與腦內(nèi)高密度的老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)有關(guān)，但目前針對上述發(fā)病環(huán)節(jié)的藥物并不能減緩或阻止AD 的進(jìn)展[1]。因此，需要進(jìn)一步研究AD 的發(fā)病機(jī)制以制定有效的治療策略。

據(jù)報(bào)道大約70%的AD 發(fā)病危險(xiǎn)因素是由遺傳引起的，通常涉及多個(gè)基因[3]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因芯片能同時(shí)對數(shù)千個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)行分析，可有效地用于研究與AD 發(fā)病相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)[4]。不同階段的AD 患者、同一階段AD 患者的不同腦區(qū)，其基因表達(dá)譜有很大差異[5,6]。大腦海馬區(qū)主要負(fù)責(zé)記憶和學(xué)習(xí)，AD 中海馬是首先受到損傷的區(qū)域，表現(xiàn)癥狀為記憶力衰退以及方向知覺的喪失，經(jīng)缺血缺氧后，海馬CA1 區(qū)發(fā)現(xiàn)明顯的神經(jīng)元損傷而出現(xiàn)空間定位和學(xué)習(xí)記憶功能障礙[7]?；虮磉_(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus datasets，GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）中的基因芯片數(shù)據(jù)GSE28146 包含從早期到晚期AD 的一系列與認(rèn)知功能障礙和神經(jīng)纖維纏結(jié)癥狀相對應(yīng)的海馬CA1 區(qū)基因表達(dá)的變化[8]。我們據(jù)此來分析AD 不同時(shí)期大腦CA1 區(qū)細(xì)胞的基因表達(dá)變化規(guī)律，期望找到在AD 不同時(shí)期共性表達(dá)的關(guān)鍵基因，以進(jìn)一步闡明AD 發(fā)病機(jī)制并為尋找新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 細(xì)胞

SH-SY5Y 細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。

2.2 主要試劑

β-淀粉樣蛋白1-42（amyloid β-protein 1-42，Aβ1-42，A9810）購自上海榮創(chuàng)生物技術(shù)有限公司；噻唑藍(lán)（Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide，MTT，ST316）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO，D806645）購自上海麥克林生化科技有限公司；TRIzol（15596-026）購自美國Invitrogen 公司，反轉(zhuǎn)錄cDNA 試劑盒（PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser，RR047A）購自日本TaKaRa 公司；SYBR 染料（SYBR Premix Ex Taq II，RR820L）購自日本TaKaRa公司。

2.3 主要方法

2.3.1 GEO數(shù)據(jù)挖掘

從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫GEO 中下載編號為GSE28146 的芯片數(shù)據(jù)原始文件，該芯片數(shù)據(jù)來源于早期、中度、重度阿爾茨海默病患者，包含總樣本數(shù)30 例，其中正常8 例，早期7 例，中度8 例，重度7 例。利用激光顯微切割術(shù)獲取石蠟包埋的大腦海馬CA1區(qū)灰質(zhì)組織，基于美國昂飛公司人類基因組U133+2.0 芯片平臺(tái)（GPL570: [HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array）的基因表達(dá)譜進(jìn)行芯片數(shù)據(jù)采集分析。本研究利用Robust Multiarray Average（RMA）算法對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了背景校正和矩陣數(shù)據(jù)歸一化處理，同時(shí)采用limma 包對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行二次分析，并結(jié)合P值和差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）進(jìn)行顯著差異基因篩選，篩選條件為P＜0.05，F(xiàn)C ＞2。

2.3.2 AD 患者不同時(shí)期（早期、中度、重度）差異基因的獲取

使用R 語言分析包以P＜0.05，F(xiàn)C ＞2為篩選條件分別篩選AD 早期患者與正常對照、AD 中度患者與正常對照、AD 重度患者與正常對照的顯著差異基因。合并篩選AD 3 個(gè)時(shí)期的差異基因，獲取在AD 早期、中度、重度均出現(xiàn)顯著差異的重合基因，利用Venny2.1（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）構(gòu) 建韋恩圖。

2.3.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network,PPI network）構(gòu)建和關(guān)鍵基因篩選

PPI network 可用于過濾和評估功能基因組數(shù)據(jù)，并對理解功能基因的產(chǎn)物蛋白的相互作用及其影響的主要生物學(xué)功能提供一個(gè)可視化的平臺(tái)[9]。探索預(yù)測AD 不同時(shí)期共同的DEGs（differentially expressed genes）的PPI 網(wǎng)絡(luò)可以為尋找AD 發(fā)生的重要作用靶點(diǎn)以及未來的防治方案提供新的方向。本文利用相互作用基因/蛋白質(zhì)檢索在線數(shù)據(jù)庫STRING（https://string-db.org/）[10]來尋找AD 不同時(shí)期共同的DEGs 的相互作用（score ≥0.4），然后使用Cytoscape-v3.6.1 進(jìn)行構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。在此基礎(chǔ)上，對PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)特征分析，通過Cytoscape 的插件CytoNCA 計(jì)算參數(shù)來評價(jià)網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)在功能上的重要性，篩選參數(shù)分別為中間中心性（Betweenness centrality，BC）和接近中心性（Closeness centrality，CC），度中心性（Degree centrality，DC）、特征向量中心性(Eigenvector centrality，EC）、基于局部平均連通性的方法（Local average connectivitybased method，LAC）、網(wǎng)絡(luò)中心性（Network centrality，NC），這6 個(gè)典型的中心屬性參數(shù)用以進(jìn)行評價(jià)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的重要性，值越大說明節(jié)點(diǎn)越接近網(wǎng)絡(luò)中心位置，即關(guān)鍵基因[11]。

2.3.4 關(guān)鍵基因的Gene Ontology和pathway富集分析

基因本體論分析（Gene Ontology，GO）（包括生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF））和KEGG通路富集分析是描述候選基因生物學(xué)特征的常用方法[12]。GOBP 是生命活動(dòng)的重要體現(xiàn)，GOBP 富集分析可以體現(xiàn)疾病發(fā)生發(fā)展的重要生物學(xué)過程[13]。我們利用（DAVID,https://david.nicifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋和富集分析，以P-Value ＜0.5 為參數(shù)獲得關(guān)鍵基因的GOBP富集條目。本研究利用生物信息學(xué)在線分析平臺(tái)Omicshare（http://www.omicshare.com）以P＜0.5、FDR ＜0.05 為參數(shù)獲取關(guān)鍵基因的pathway 富集信息。

2.3.5 細(xì)胞造模及細(xì)胞活力檢測

SH-SY5Y 用含10%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素的DMEM/F12 培養(yǎng)基在37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長處于對數(shù)期時(shí)，按8×103個(gè)/孔的細(xì)胞密度轉(zhuǎn)移到96 孔板中，培養(yǎng)12 h 使其貼壁，分別設(shè)立正常組、Aβ1-42造模組（1.25，2.5，5，10，20，40 μmol·L-1）。各組細(xì)胞培養(yǎng)24h 后加入5 mg·mL-1MTT 溶液10 μL，37℃孵育4 h 后棄上清并加入DMSO 200 μL 每孔，酶標(biāo)儀上震蕩30 min，490 nm 波長處測定吸光度A，細(xì)胞的生存率=（A 實(shí)驗(yàn)組-A 調(diào)零孔）/（A空白組-A調(diào)零孔）×100%，每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

2.3.6 關(guān)鍵基因的表達(dá)qPCR驗(yàn)證

細(xì)胞培養(yǎng)方法如1.5，按5 × 105個(gè)/孔的細(xì)胞密度轉(zhuǎn)移到6孔板中培養(yǎng)12 h使其貼壁，分別設(shè)立正常組、Aβ1-42（10 μmol·L-1）造模組，培養(yǎng)24 h 后提取總RNA?？俁NA 提取使用TRIzol, 反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA 使用

TaKaRa PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser。采用SYBR Premix Ex Taq II 和CFX96 熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國），按照試劑盒說明書對篩選出的5個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行qPCR 驗(yàn)證。所用引物序列從NCBI數(shù)據(jù)庫獲取，使用Primer Premier6.0 軟件設(shè)計(jì)并由華大基因有限公司進(jìn)行合成（表1）。

表1 引物序列

2.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用Prism GraphPad 6.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 AD 患者不同時(shí)期（早期、中度、重度）差異基因的分析

二次挖掘分析GEO 芯片數(shù)據(jù)庫的基因芯片GSE28146，以P＜0.05，差異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）＞2 為篩選分析AD 早期患者與正常對照組的基因差異表達(dá)情況，芯片結(jié)果顯示共有2314 差異表達(dá)基因；AD中度患者與正常對照組比較共有1782 個(gè)基因差異表達(dá)；AD 重度患者與正常對照組比較存在929個(gè)顯著差異基因。其中，在AD 三個(gè)時(shí)期均存在差異表達(dá)的基因有419 個(gè)（如圖1），其中上調(diào)基因有235 個(gè)，下調(diào)基因有184個(gè)。

3.2 AD差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)分析及關(guān)鍵基因篩選

將419 個(gè)與AD 相關(guān)性蛋白靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING數(shù)據(jù)庫獲取這些靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖2），其中249 個(gè)蛋白之間存在498種相互作用關(guān)系。采用CytoNCA 計(jì)算PPI 網(wǎng)絡(luò)的BC、CC、DC、EC、LAC 和NC 值并進(jìn)行篩選（圖3），這些參數(shù)中DC 值大于兩倍中位數(shù)值的節(jié)點(diǎn)為重要節(jié)點(diǎn)，所以第一次篩選采用DC 大于兩倍中位數(shù)即DC ＞4 進(jìn)行篩選，得到初步篩選出的網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)有86 個(gè)節(jié)點(diǎn)，285 個(gè)邊，在此基礎(chǔ)上以DC ＞8.3489、EC ＞ 0.0675、BC ＞ 172.8372、CC ＞ 0.3414、NC ＞3.8023、LAC ＞2.5763 對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行第二次篩選，得到核心網(wǎng)絡(luò)[11,14]。該網(wǎng)絡(luò)有12 個(gè)節(jié)點(diǎn)存在48 種相互作用關(guān)系，因此該12個(gè)核心靶點(diǎn)確定為AD發(fā)生過程中的關(guān)鍵基因（表2）。

圖2 AD相關(guān)的蛋白靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 關(guān)鍵基因的PPI網(wǎng)絡(luò)分析.

表2 關(guān)鍵基因的差異表達(dá)（AD VS. Control）

圖4 關(guān)鍵基因的富集分析

3.3 關(guān)鍵基因的GO分析和pathway分析

為了進(jìn)一步了解關(guān)鍵基因的作用，通過GO 和KEGG 通路富集分析來初步揭示它們在AD 發(fā)生過程中起到的生物學(xué)作用。結(jié)果表明靶點(diǎn)參與的生物過程為一氧化氮合酶活性調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、缺氧反應(yīng)、細(xì)胞間黏著、聚集過程、蛋白質(zhì)乙?；?、MAPK 復(fù)合物調(diào)控、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路調(diào)控以及胰島素受體信號通路調(diào)控（圖4A）等，其中一氧化氮合酶活性調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、MAPK復(fù)合物調(diào)控等都為AD發(fā)生過程中的關(guān)鍵過程[15]。此外，這些關(guān)鍵基因主要參與了Rap1 信號通路、Ras 信號通路、NF-κB 信號通路、TNF 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、Phospholipase D 信號通路、Jak-STAT 信號通路、Calcium 信號通路（圖4B）。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在這些通路中，Ras 信號通路和PI3K-Akt信號通路在AD 發(fā)生過程中起著重要作用，AD 發(fā)生過程中Ras表達(dá)增加激活糖原合成酶激酶3（GSK-3），導(dǎo)致APP和Tau過度磷酸化，引起AD 大腦中的β淀粉樣蛋白沉積和神經(jīng)纖維纏結(jié)[16,17]。同時(shí)Ras 蛋白作為信號通路的分子開關(guān)，調(diào)控下游PI3K-Akt 信號通路和MAPK信號通路，參與氧化應(yīng)激、自噬、凋亡、炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)過程[18,19]。而PI3K-Akt 信號通路、NFκB 信號通路、TNF 信號通路等參與神經(jīng)炎癥反應(yīng)，與AD發(fā)生也密切相關(guān)。

3.4 AD細(xì)胞模型構(gòu)建及關(guān)鍵基因的qPCR驗(yàn)證

SH-SY5Y 細(xì)胞衍生于人的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SK2N 2SH，該細(xì)胞分化后具有神經(jīng)元樣的形態(tài)，表達(dá)神經(jīng)元特異性的標(biāo)志物，表現(xiàn)出人神經(jīng)元的特性，該細(xì)胞系被廣泛運(yùn)用于神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制的研究。本研究以不同濃度Aβ1-42刺激SH-SY5Y細(xì)胞構(gòu)建AD 細(xì)胞模型，MTT 檢測細(xì)胞活力顯示在Aβ1-42刺激后SH-SY5Y 細(xì)胞活力隨濃度呈下降趨勢（圖5A），Aβ1-42濃度為10 μm·L-1刺激下細(xì)胞生存率為55 ± 6.8%，故選擇10 μm·L-1Aβ1-42建立AD 細(xì)胞模型。TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA 逆轉(zhuǎn)錄cDNA 后，使用設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行qPCR 驗(yàn)證。結(jié)果顯示，與正常組比較，Aβ1-42處理后EGFR、MMP2 表達(dá)明顯下降（P＜0.05），IL1B、BCL2L1、KITLG表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）（圖5B），挑選的5個(gè)關(guān)鍵基因qPCR表達(dá)結(jié)果與芯片結(jié)果一致。

圖5 AD細(xì)胞模型的建立及關(guān)鍵基因的qPCR驗(yàn)證

4 討論

大腦海馬區(qū)屬于腦的邊緣系統(tǒng)（limbic system）中的重要結(jié)構(gòu)，與學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知功能有關(guān)，尤其是短期記憶與空間記憶[20]。大量研究證實(shí)海馬的損傷會(huì)導(dǎo)致長期情景記憶的嚴(yán)重?fù)p害，這表明海馬在學(xué)習(xí)和記憶中起著重要作用[21,22]，特別是CA1 區(qū)被認(rèn)為是長時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)形成的關(guān)鍵部位，因?yàn)樗墙橛诤ｑR和皮質(zhì)/皮質(zhì)下區(qū)域之間的信息通道[23,24]。AD 患者與非癡呆患者的大腦相比，海馬CA1 區(qū)通常表現(xiàn)出明顯的萎縮，神經(jīng)元和突觸的數(shù)量減少[25]。近年來，有學(xué)者提出CA1 區(qū)的病理改變是認(rèn)知障礙患者記憶功能障礙的重要指標(biāo)[26]。

目前普遍認(rèn)為，在AD的病理過程中，tau蛋白過度磷酸化導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）、細(xì)胞外淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）積聚所形成的老年斑是AD 發(fā)生的主要病理生理機(jī)制[27]。為了進(jìn)一步了解核心基因在AD中的作用，我們從GEO數(shù)據(jù)庫獲取了不同時(shí)期AD患者大腦CA1區(qū)灰質(zhì)的基因表達(dá)譜，運(yùn)用生物信息學(xué)方法篩選出在AD 發(fā)生的不同時(shí)期均出現(xiàn)表達(dá)異常的基因并構(gòu)建了PPI 網(wǎng)絡(luò)，這些基因的異常表達(dá)引起蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)調(diào)控異?？赡苁菍?dǎo)致AD 出現(xiàn)病理特征的關(guān)鍵所在[28]，因此我們進(jìn)一步分析PPI 網(wǎng)絡(luò)獲取了網(wǎng)絡(luò)中相互作用最多的12個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，這些關(guān)鍵基因的失調(diào)可能是導(dǎo)致AD 發(fā)生的重要因素，它們也可能是治療AD的潛在生物標(biāo)志物或藥物靶點(diǎn)。

為了進(jìn)一步明確關(guān)鍵基因在AD 發(fā)生過程中發(fā)揮的生物學(xué)功能，我們利用DAVID 數(shù)據(jù)庫和Omicshare在線分析工具對這些關(guān)鍵基因進(jìn)行生物學(xué)過程和代謝通路的富集分析，發(fā)現(xiàn)它們主要與一氧化氮合酶活性調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、缺氧反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)。我們結(jié)合文獻(xiàn)檢索分析結(jié)果預(yù)測AD 的不同階段海馬CA1 區(qū)差異表達(dá)的基因與AD 發(fā)生的聯(lián)系主要為：①神經(jīng)炎癥反應(yīng)及相關(guān)通路的調(diào)控是影響AD 發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。Aβ 的沉積和神經(jīng)纖維纏結(jié)引起神經(jīng)元炎癥反應(yīng)，神經(jīng)炎癥反應(yīng)的激活伴隨著許多促炎因子，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1-β（IL-1β）、白介素6（IL-6）以及活性氮及活性氧的釋放，促炎因子毒性作用的累積會(huì)導(dǎo)致慢性神經(jīng)炎癥，從而引起神經(jīng)元死亡[29]。炎性細(xì)胞因子的釋放又可以反過來促進(jìn)β 淀粉樣前體蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)AD 的發(fā)生[30]。②PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、以及NF-κB信號通路在內(nèi)的炎癥反應(yīng)途徑介導(dǎo)了神經(jīng)炎癥的發(fā)生機(jī)制。多種介質(zhì)和信號通路之間復(fù)雜的相互作用產(chǎn)生各種炎癥因子和神經(jīng)炎性反應(yīng)促進(jìn)AD 的發(fā)生發(fā)展。細(xì)胞外介質(zhì)可調(diào)節(jié)不同的信號級聯(lián)，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞生存或死亡，發(fā)揮最終的神經(jīng)系統(tǒng)功能，其中PI3K/AKT、MAPK 在激活NF-κB 中發(fā)揮重要作用[31,32]。在AD 進(jìn)展過程中，NF-κB 作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑在炎癥，神經(jīng)元存活，分化，細(xì)胞凋亡，神經(jīng)突生長，突觸可塑性發(fā)揮重要作用[33]。在AD 中，Aβ 刺激促使NF-κB 被激活，產(chǎn)生大量的促炎細(xì)胞因子，進(jìn)而作用于神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)其表達(dá)更多的細(xì)胞因子和趨化因子，形成惡性循環(huán)，也間接促進(jìn)了神經(jīng)元死亡[34]。

本研究采用生物信息學(xué)方法分析不同階段AD 患者海馬CA1 區(qū)差異表達(dá)的基因，以闡明AD 發(fā)生的分子機(jī)制。結(jié)果表明一些基因的表達(dá)失調(diào)可能是導(dǎo)致AD 發(fā)生的重要因素，這些關(guān)鍵基因可能通過神經(jīng)炎癥影響AD 的發(fā)生發(fā)展，證實(shí)了神經(jīng)炎癥促進(jìn)AD 的發(fā)病的關(guān)系，對AD 治療的潛在生物標(biāo)志物或藥物靶點(diǎn)的研究有重要意義。