蔡蕭君，王 磊，頡彥鵬，蒙艷麗，許慶瑞，侯鳳艷，陸振華，王旭玲

（黑龍江省中醫(yī)藥科學院 哈爾濱 150036）

抑郁癥（depression）是一種常見的精神疾病，世界衛(wèi)生組織2017 的報告顯示，全世界有超過3 億的人受到影響[1]。抑郁癥極大地降低了個體的生活質(zhì)量，并使其在工作、學校和家庭中表現(xiàn)不佳，甚至可能導致自殺，其源自社會、心理和生物因素的復雜交互作用[2,3]。盡管對抑郁癥的研究廣泛，但針對抑郁癥的分子生物學機制仍知之甚少。目前，抑郁癥的診斷主要依賴于精神科醫(yī)師對癥狀群的主觀識別，導致誤診率高[4-6]。由于缺乏客觀的診斷方法，只有不到一半的抑郁癥患者（在許多國家，只有不到10%）接受有效的治療[7,8]。因此，抑郁癥的客觀診斷方法將具有相當?shù)呐R床價值。

寧神靈由黑龍江省中醫(yī)藥科學院國醫(yī)大師張琪研制，用于頭昏頭痛、心煩易怒、心悸不寧、胸悶少氣、少寐多夢，具有舒肝開郁，鎮(zhèn)驚安神之效，具有直接調(diào)節(jié)神經(jīng)功能，營養(yǎng)神經(jīng)細胞及減輕神經(jīng)細胞膜性損害的臨床有效藥物[9-12]，曾獲得布魯塞爾尤里卡國際發(fā)明博覽會銀獎。但基于中藥多成分多靶標的作用機制和特點，采用有限的檢測技術及方法難以進行全面的表征，這使得中藥的有效性、體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎和作用機制的相關說明受到極大限制。本研究首次采用代謝組學技術探討寧神靈已報到有效成分的體內(nèi)作用靶標及代謝機制，為寧神靈的新藥研發(fā)和抑郁癥靶向研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

TripleTOF 5600+LC/MS/MS 系統(tǒng)（美國AB SCIEX 公司）；ML-T 分析天平（瑞士梅特勒托利多）；VDUPL超純水機（九方沃德科技有限公司）；Morri 水迷宮（安徽淮北正華生物儀器有限公司）；寧神靈顆粒由黑龍江省中醫(yī)研究院制藥廠提供（批準文號：國藥準字Z20055040）。

表1 尿液UPLC流動相梯度洗脫方法

1.2 動物

雄性SD大鼠，體重170-220 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。實驗開始前大鼠在動物室適應7 d，給予標準實驗室水和食物喂養(yǎng)，動物室保持溫度22-26℃和相對濕度50 ± 5%，光/暗12循環(huán)。

1.3 動物分組及代謝樣本制備

30只SD大鼠隨機分為3組，即空白組、模型組、寧神靈組。參考CUMS 模型建立方法[13]，給予18℃游泳10 min，4℃環(huán)境下1 h，束縛1 h，3 h 循環(huán)光照，光照過夜，周期42 d?？瞻捉M和模型組給予生理鹽水（0.3 mL）和自由飲食，寧神靈組于應激2 周后給予5 g/kg/d的寧神靈藥液。實驗第43 天早收集夜尿12 h，在4℃下以轉(zhuǎn)速13000 rpm·min-1離心10 min，取上清液置于EP管中，于-80℃下保存，進樣前再次按上述參數(shù)離心過0.22 μm濾膜作為代謝物供試品溶液。

1.4 SD大鼠Morris水迷宮測試

1.4.1 定位航行實驗

實驗階段隔1 星期進行1 次水迷宮適應性實驗，實驗第43 d 正式進入定位航行實驗，記錄各組大鼠找到平臺花費時間。

1.4.2 空間探索實驗

定位航行后進行空間探索實驗，撤出水中平臺，記錄大鼠1 min 內(nèi)穿越平臺的次數(shù)和其在附近逗留的時間。

1.4.3 糖水偏愛率實驗

大鼠禁食24小時候，給予1%的蔗糖水溶液，同時再次禁食。消耗量百分率（%）=實驗前瓶體總質(zhì)量-實驗后瓶體總質(zhì)量/實驗前瓶體總質(zhì)量×100%。實驗周期1 h。

1.5 代謝數(shù)據(jù)采集

色譜柱：ACQUITY UPLCTMHSS T3（100 mm×2.1 mm i.d., 1.8 μm）（Waters 集團公司，美國）；流動相A 為0.13%甲酸-水，B 為0.1%甲酸-乙腈；柱溫：40℃；流速：0.4 ml/min；進樣量：3 μL；梯度洗脫方法見表1。離子噴霧電壓：5.5 KV；離子源溫度：600℃；解簇電壓（DP）：100 V；碰撞能量（CE）：35 eV。氮氣為霧化氣和輔助氣：霧化氣55 psi，輔助氣55 psi，氣簾氣35 psi。在m/z 在100-1200 amu 質(zhì)量范圍進行全掃描，積累時間250 ms。IDA 采用標準：每個分析物，超過100 cps的八個最強的碎片離子在100-1200 amu 質(zhì)量范圍內(nèi)進行子離子掃描，累積時間為100 ms。碰撞電壓差為15 eV，動態(tài)背景扣除DBS。

1.6 數(shù)據(jù)處理

動物行為學數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 的Student's TTEST 分析比較組間差異，以P＜0.05 為標準進行分析；代謝數(shù)據(jù)獲取和處理分析采用PeakView?2.1 軟件、MasterView 軟件和ProgenisisQI 1.0 軟件。工作站為Analyst?TF1.6 軟件。篩選標準為VIP 大于1、TTEST ＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮結(jié)果

2.1.1 定位航行能力結(jié)果

與空白組相比，模型組大鼠定位平臺時間顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比，寧神靈組定位平臺的時間明顯減少（P＜0.05），見表2。結(jié)果說明模型組大鼠定位能力下降，給予寧神靈后有顯著治療作用。

2.1.2 空間探索能力結(jié)果

與空白組相比，模型組大鼠的穿越平臺次數(shù)和靶象限停留時間明顯減少（P ＜0.05），與模型組比較，寧神靈湯組平臺穿越次數(shù)和靶象限停留時間明顯增加（P＜0.05），見表3。結(jié)果說明寧神靈能夠一定程度地改善抑郁癥。

2.1.3 大鼠糖水偏愛率實驗結(jié)果

模型制備過程中每隔1周測定一次蔗糖水消耗結(jié)果。模型組顯著低于空白組，說明模型建立成功。寧神靈組優(yōu)于模型組，但與空白組比較無明顯差異，結(jié)果見表4。

表2 各組大鼠水迷宮定位航行結(jié)果

表3 各組大鼠空間探索能力結(jié)果

表4 抑郁癥大鼠蔗糖水消耗結(jié)果

2.2 代謝組學研究

本部分基于AB TripleTOF 5600+LC/MS/MS 高分辨質(zhì)譜技術對抑郁癥大鼠模型尿液進行代謝指紋分析。將海量的代謝數(shù)據(jù)帶入最新代謝組學生物信息處理軟件Progenesis QI（Waters 集團公司，美國）進行數(shù)據(jù)預處理。通過峰對齊、歸一化、去噪平滑、降維后的數(shù)據(jù)帶入EZinfo 3.0（Waters 集團公司，美國）進行模式識別分析（圖1）。從對分組影響最大的二維數(shù)據(jù)中可知，空白組和模型組組內(nèi)聚類良好、組間差異明顯，寧神靈組處于兩組間，且整體趨勢和代謝輪廓與空白組相一致。證明寧神靈組SD 大鼠的機體狀態(tài)已向健康發(fā)展，由此推斷，寧神靈對抑郁癥有很好的治療作用。進一步采用偏最小二乘判別分析篩選對分組貢獻最大的小分子代謝產(chǎn)物（圖4），結(jié)合Progenesis QI內(nèi)嵌標準品數(shù)據(jù)庫鑒定與抑郁癥相關的11 個尿液生物標記物（見表5）。分別是苯丙氨酸、酪氨酸、賴氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、組氨酸脯氨酸、泛酸、二羥基丙酮磷酸鹽、3-羥基丁酸、肌酐、腺苷。代謝通路圖如圖3所示。經(jīng)組學代謝通路富集分析（圖2）可知其主要涉及①丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝，②甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，③泛酸和輔酶A 生物合成，④賴氨酸降解，⑤苯丙氨酸代謝，⑥賴氨酸生物合成，⑦氨基?；?tRNA生物合成。

表5 抑郁癥大鼠尿液生物標志物詳表

圖1 空白組、抑郁癥組及寧神靈組的2D得分圖

3 討論

本文首次采用代謝組學技術對抑郁癥大鼠進行研究，在確定尿液生物標記物的同時，評價寧神靈的治療作用。從抑郁癥代謝機制研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氨基酸代謝、能量代謝等與抑郁癥密切相關。

圖2 抑郁癥大鼠代謝通路富集分析結(jié)果

氨基酸代謝紊亂在之前的已有報道，如重度抑郁癥患者的血漿[14]和不同腦區(qū)（包括抑郁癥大鼠模型皮質(zhì)、海馬和下丘腦）中已得到證實[15]。本實驗中，苯丙氨酸、酪氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸均顯著下調(diào)，而甘氨酸在抑郁大鼠小腦中明顯上調(diào)，提示動物的能量代謝功能失調(diào)。相反，抑郁癥大鼠小腦中相關的糖酵解和TCA 循環(huán)代謝物，包括泛酸、肌酐和3-羥基丁酸均減少。肌酐是肌酸和磷酸肌酸的非酶副產(chǎn)物，肌酸-磷酸肌酸系統(tǒng)對細胞能量傳輸至關重要。抑郁癥大鼠小腦中這些代謝物的較低水平可能表明能量缺乏，這是疲勞的重要因素，同樣是重度抑郁癥患者最常見的癥狀之一[16]。根據(jù)終產(chǎn)物反饋誘導和中間體介導的前饋誘導機制[17]，這里觀察到的糖酵解和TCA 循環(huán)酶的變化可能是由抑郁癥大鼠中這些受抑制的代謝物水平的降低所誘導的。

圖3 抑郁癥大鼠模型尿液代謝通路示意圖

抑郁大鼠小腦中相關的糖酵解和TCA 循環(huán)代謝物，包括泛酸、磷酸二羥丙酮（DHAP）、肌酐和3-羥基丁酸均減少。肌酐是肌酸和磷酸肌酸的非酶副產(chǎn)物，肌酸-磷酸肌酸系統(tǒng)對細胞能量傳輸至關重要。這些代謝物在抑郁大鼠小腦中的較低水平可能表明能量缺乏，這是疲勞的重要因素，是抑郁癥患者最常見的癥狀之一。根據(jù)終產(chǎn)物反饋誘導和中間體介導的前饋誘導機制，在抑郁大鼠中觀察到的糖酵解和TCA 循環(huán)酶的變化可能是由于這些受抑制的代謝物水平降低所致。

腺苷是ATP 生物合成的重要底物，在抑郁大鼠的小腦中增加。有研究表明腺苷對小鼠的抗抑郁作用[18]。然而這種效應是否與ATP 生物合成有關，還需要進一步研究。本次結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腺苷催化ATP 生物合成中三種酶：腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（APRT）、ATP 合成酶和Na+、K+-ATPase。APRT 催化形成AMP的補救反應。ATP 合成酶將跨膜質(zhì)子轉(zhuǎn)運與ADP 和無機磷酸鹽合成ATP 偶聯(lián)。Na+，K+-ATPase 以高濃度存在于腦細胞膜中，消耗了大約40%-50%的腦組織產(chǎn)生的ATP，在抑郁大鼠海馬突觸漿膜中其活性顯著降低。腺苷、APRT 和ATP 合成酶水平的升高與Na+、K+-ATPase 的平行下調(diào)共同提示抑郁大鼠小腦ATP生物合成過程被激活。

圖4 基于Progenesis QI平臺的苯丙氨酸的二級鑒定結(jié)果

本研究通過小柴胡湯有效成分黃芩苷及黃芩素藥物配體的特定結(jié)構(gòu)，采用代謝組學探究抑郁癥大鼠體內(nèi)代謝機制及評價寧神靈的治療作用。通過代謝通路富集分析可知抑郁癥大鼠體內(nèi)代謝主要涉及氨基酰基-tRNA 生物合成、氮代謝、硫胺素代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、嘌呤代謝、苯丙氨酸代謝、賴氨酸降解、酮體的合成與降解、精氨酸與脯氨酸代謝、生物素代謝、谷氨酰胺和谷氨酸代謝、氰氨基酸代謝、丙氨酸，天門冬氨酸和谷氨酸代謝、泛酸和輔酶A 生物合成、β-丙氨酸代謝、糖酵解或糖異生、甘油酯代謝、丙酮酸代謝、賴氨酸生物合成、甲烷代謝、萜類醌泛醌和其他生物合成、谷胱甘肽代謝、甘油磷脂代謝、肌醇磷酸代謝、丁酸代謝、半乳糖代謝、煙酸酯和煙酰胺代謝、初級膽汁酸生物合成、果糖與甘露糖代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、戊糖和葡糖醛酸鹽相互轉(zhuǎn)化、嘧啶代謝、酪氨酸代謝、卟啉與葉綠素代謝。通過高通量質(zhì)譜技術獲取抑郁癥大鼠體內(nèi)生物學信息，并采用無監(jiān)督模式識別方法進行分析可全面快速的明晰抑郁癥的發(fā)病機制，為中藥抗抑郁的作用機制研究及寧神靈抗抑郁藥效物質(zhì)基礎研究奠定機制。