張德利 ，刁慶春 ，涂彩霞 ，林茂

（1.西南醫(yī)科大學(xué)，四川瀘州646000；2.重慶市中醫(yī)院，重慶400011；3.大連醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，遼寧大連116027）

白癜風(fēng)是一種常見的獲得性的色素脫失性皮膚病，發(fā)病機(jī)制不清，治療困難。近年來，有學(xué)者提出白癜風(fēng)的綜合發(fā)病機(jī)制學(xué)說：在遺傳學(xué)背景基礎(chǔ)上，氧化應(yīng)激造成局部黑素細(xì)胞損傷及凋亡，誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)攻擊更多的黑素細(xì)胞，造成進(jìn)行性的皮膚色素脫失[1]，但氧化應(yīng)激如何啟動(dòng)自身免疫反應(yīng)尚不清楚。

遺傳學(xué)研究顯示，白癜風(fēng)X-box結(jié)合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP1）啟動(dòng)子區(qū)域的遺傳變異與白癜風(fēng)發(fā)病密切相關(guān)，且皮損中XBP1表達(dá)明顯增加[2]。XBP1是一種多功能核轉(zhuǎn)錄因子，被剪切后的XBP1（XBP1s）可調(diào)節(jié)多種下游基因轉(zhuǎn)錄，可能促進(jìn)黑素細(xì)胞黑素小體自噬，釋放自身抗原[3]；促進(jìn)B細(xì)胞活化[4]，分泌針對(duì)黑素細(xì)胞的自身抗體；促進(jìn)樹枝狀細(xì)胞傳遞自身抗原[5]，激活CD8+T細(xì)胞攻擊黑素細(xì)胞，從而引發(fā)自身免疫反應(yīng)，破壞黑素細(xì)胞，因此可能是氧化應(yīng)激引起的白癜風(fēng)自身免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵因素。

黃酮類化合物在多種細(xì)胞系中具有強(qiáng)大的抗氧化生物學(xué)效應(yīng)[6]。芹黃素屬于黃酮類化合物，廣泛存在于芹菜、大蒜、蘋果等蔬菜水果，及地錢、西藏雪蓮花等中草藥中[7]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，芹黃素可通過抑制ROS產(chǎn)生，減少氧化應(yīng)激引起的黑素細(xì)胞凋亡[8]。但芹黃素可否可抑制氧化應(yīng)激引起的XBP1表達(dá)升高，從而抑制其自身免疫激活，目前尚未見報(bào)道。因此，本文擬通過建立體外過氧化氫誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，檢測(cè)芹黃素對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的XBP1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

1.1.1 材料

1.1.1.1 細(xì)胞 人永生化HaCat細(xì)胞株購自上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.1.1.2 主要試劑 芹黃素（Apigenin，Sigma，美國）、30%過氧化氫（H2O2，Sigma，美國）、N－乙酰半胱氨酸（Acetylcysteine，NAC，Sigma，美國）、胰蛋白酶（Gibico，美國）、乙二胺四乙酸（EDTA，Sigma，美國）、二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，Sigma，美國）、2'，7'-二氯氫化熒光素探針（DCFDA，Sigma，美國）。RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，日本）。PCR引物由Takara公司大連分公司合成。

1.1.2 儀器 自動(dòng)酶標(biāo)儀（Thermo，芬蘭）、流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson，美國）、7500型實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)儀（ABI，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HaCat細(xì)胞株常規(guī)方法復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清DMEM低糖培養(yǎng)基，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)（37℃，相對(duì)濕度95%），2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞制成5×104/mL單細(xì)胞懸液，接種于96孔板或6孔板后繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞活力測(cè)定 不同濃度的芹黃素作用于HaCat細(xì)胞12 h后，采用四甲基偶氮唑蘭比色法（MTT法）。96孔板每孔加5 g/L MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔加100 μL DMSO，低速震蕩5 min，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，測(cè)定波長490 nm。

1.2.3 活性氧含量檢測(cè) 采用DCF-DA法[9]。培養(yǎng)的HaCat細(xì)胞加入25 μmol/L芹黃素或10 mmol/L的NAC（陽性對(duì)照）預(yù)處理1 h，再加入500 μmol/L的H2O2作用12 h，空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組處理同上。培養(yǎng)細(xì)胞加入10 μmol/L DCF-DA，37℃孵箱中孵育30 min，消化收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗3次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，檢測(cè)波長488/525 nm。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化、離心，收集細(xì)胞，利用TaKaRa細(xì)胞總RNA抽提試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，采用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用熒光定量PCR試劑盒按照說明書以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后使用ABI 7500 PCR儀進(jìn)行熒光PCR。引物序列見表1。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，每循環(huán)中，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸45 s，采集熒光信號(hào)；40循環(huán)結(jié)束后，經(jīng)94℃30 s、57℃30 s、72℃45 s，采集熔解曲線。使用7500型Real-time PCR儀分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以GAPDH為內(nèi)參基因，計(jì)算同一樣本中目的基因與內(nèi)參基因的含量比值，評(píng)價(jià)目的基因的表達(dá)水平。每個(gè)樣本取3個(gè)復(fù)孔，PCR重復(fù)3次。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 芹黃素對(duì)HaCat細(xì)胞活力的影響 芹黃素濃度≤25 μmol/L時(shí)，對(duì)HaCat細(xì)胞活力無明顯影響，無細(xì)胞毒性（P＞0.05），見圖 1。

圖1 芹黃素對(duì)HaCat細(xì)胞活力的影響

2.2 芹黃素抑制過氧化氫引起的HaCat細(xì)胞ROS含量升高 500 μmol/L的過氧化氫可顯著誘導(dǎo)Ha－Cat細(xì)胞 ROS 含量升高（P＜0.01）；10 μmol/L 及 25 μmol/L的芹黃素可顯著抑制過氧化氫引起的HaCat細(xì)胞ROS含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。

圖2 芹黃素對(duì)H2O2引起的HaCat細(xì)胞ROS含量升高的影響

2.3 芹黃素抑制過氧化氫引起的HaCat細(xì)胞的XBP1s mRNA表達(dá)升高 500 μmol/L的過氧化氫可顯著誘導(dǎo)HaCat細(xì)胞XBP1s mRNA表達(dá)（P＜0.01）；10 μmol/L及25 μmol/L的芹黃素可顯著抑制過氧化氫引起的HaCat細(xì)胞XBP1s mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖3。而過氧化氫或芹黃素對(duì)Hacat細(xì)胞未剪切的XBP1（XBP1u）的mRNA水平無明顯影響，見圖4。

圖3 芹黃素對(duì)H2O2引起的HaCat細(xì)胞XBP1s mRNA表達(dá)升高的影響

圖4 芹黃素對(duì)H2O2引起的HaCat細(xì)胞XBP1u mRNA表達(dá)升高的影響

3 討論

在白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制研究中，近年來發(fā)現(xiàn)XBP1可能在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)自身免疫的過程中起重要作用。XBP1是未折疊蛋白應(yīng)答（Unfolded protein response，UPR）信號(hào)通路中的標(biāo)志性信號(hào)之一。氧化應(yīng)激可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic reticulum stress，ER stress），激活 UPR，使得 XBP1 mRNA 發(fā)生剪切，剪切后的XBP1即XBP1s，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，調(diào)節(jié)多種自身免疫相關(guān)的基因表達(dá)[9]。最近的研究發(fā)現(xiàn)XBP1活化可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌趨化因子CXCL 16，誘導(dǎo)CD8+T淋巴細(xì)胞趨化；還可促進(jìn)黑素細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、8[10]，可促進(jìn)B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞分泌抗體[4]，可維持樹枝狀細(xì)胞存活和功能[5]；還可調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬[3]。因此，對(duì)XBP1的調(diào)控可能有助于阻斷白癜風(fēng)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)，成為重要的治療靶點(diǎn)。在本研究中，筆者根據(jù)前期文獻(xiàn)報(bào)道[11]，選用500 μmol/L的過氧化氫誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞氧化應(yīng)激，并證實(shí)其可明顯增加XBP1s的表達(dá)，可用于抗氧化藥物的檢測(cè)。

芹黃素是黃酮類化合物，具有明顯的體內(nèi)及體外抗氧化作用[7]，筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，芹黃素可通過抑制ROS產(chǎn)生，減少氧化應(yīng)激引起的黑素細(xì)胞凋亡[8]；但其是否對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的氧化應(yīng)激具有拮抗作用，是否對(duì)XBP1的表達(dá)具有調(diào)控作用尚未見報(bào)道。本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)芹黃素濃度小于或等于25 μmol/L時(shí)，對(duì)HaCat細(xì)胞活力無明顯影響。10 μmol/L及25 μmol/L的芹黃素可顯著抑制過氧化氫引起的HaCat細(xì)胞ROS含量升高，顯著抑制過氧化氫引起的HaCat細(xì)胞XBP1s mRNA表達(dá)升高，而對(duì)未剪切的XBP1（XBP1u）的mRNA水平無明顯影響。這些結(jié)果說明，芹黃素可能通過抑制XBP1s表達(dá)，對(duì)白癜風(fēng)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的自身免疫具有一定的拮抗作用。

綜上所述，芹黃素可能通過抗氧化，對(duì)過氧化氫引起的XBP1s表達(dá)升高具有抑制作用，因而可能具有開發(fā)成為治療白癜風(fēng)的新藥的前景。