楊天時，于 新，王晶瑩，謝 風(fēng)，何成彥

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗科，吉林 長春130033)

腎癌主要是由腎小管上皮細(xì)胞起源的，又被稱為腎細(xì)胞癌(RCC) ，主要在泌尿小管的各個不同位置分布。相關(guān)統(tǒng)計指出，目前腎癌在多種成人惡性腫瘤中所占比例約為2%-3%。在我國，腎癌的發(fā)病率位居于第三位，僅位于膀胱癌和前列腺癌之后，是泌尿系統(tǒng)中較為常見的腫瘤，可導(dǎo)致患者的死亡，近些年在全世界的發(fā)病率有明顯上升的趨勢[1]。人體內(nèi)的serPin可分成九個亞家族，即：A-I，其中，最大的兩個家族是類卵清蛋白家族和類α1-抗胰蛋白酶家族。人類最主要的蛋白酶抑制物，即絲氨酸蛋白酶抑制劑A1是一種蛋白質(zhì)，有著高度的保守結(jié)構(gòu)，其比例在血漿總蛋白酶的抑制能力中可達(dá)90%以上[2]。作為急性時性反應(yīng)蛋白，絲氨酸蛋白酶抑制劑A1大部分是在肝細(xì)胞內(nèi)合成的，在腸上皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞及腎實質(zhì)等肝外組織及某些腫瘤細(xì)胞中也可以產(chǎn)生[3]。有研究顯示，絲氨酸蛋白酶抑制劑在患有肝癌、肺癌、膀脫癌等惡性腫瘤的患者體內(nèi)表達(dá)水平也會增高。但截止至目前，在腎癌中關(guān)于serPinA1的研究仍比較少，因此本實驗采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)及Western blotting兩種方法，目的在于研究在腎癌及癌旁健康組織中serPinA1的表達(dá)情況及臨床意義，為腎癌的發(fā)病機(jī)制、臨床診斷及治療提供有益線索。

1 材料與方法

1.1材料

選取吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院腎內(nèi)科及泌尿外科已經(jīng)接受手術(shù)治療的患者，從中選取腎癌組織標(biāo)本36例，確保這些患者在進(jìn)行手術(shù)前未應(yīng)用任何方式治療。在患者進(jìn)行手術(shù)當(dāng)中即時沖洗取材，取材后及時的用液氮速凍封存。本實驗所用的腎癌組織標(biāo)本均為病理學(xué)檢查證實有效，癌旁正常組織均取自癌組織上緣。

1.2儀器及試劑

取自總部位于加州的伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司(Bio-Rad公司)的蛋白質(zhì)定量試劑盒?？捡R斯亮藍(lán)-G250，默克密理博(Milli-QIntegral)超純水發(fā)生裝置于碧云天生物技術(shù)公司購得。LT_QXL線性離子肼質(zhì)譜儀、UV-2000型分光光度計于賽默飛世爾公司購得。1200納升級液相色譜分析儀于美國安捷倫科技公司購得。DNA酶及RNA酶于西格瑪公司(美國)購得。PMSF、TPCK、DTT、TMED于美國GE公司購得。

1.3實驗方法

1.3.1提取樣本的總蛋白，檢測其濃度將50 mg腎癌組織及癌旁健康組織在液氮凍存的環(huán)境中取出來，并將兩種標(biāo)本磨成粉末。研磨后向其中加入已經(jīng)制備好的裂解緩沖液，目的是為了去除DNA和RNA。然后用離心機(jī)離心后吸取標(biāo)本的上清液，即為總蛋白質(zhì)。用微量蛋白質(zhì)快速測定法，即布拉德福德(Brandford)法測定蛋白濃度，用考馬斯亮藍(lán)-G250染色，用分光光度計在595 nm處測定吸光度并繪制曲線(以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，A595 nm為縱坐標(biāo))，根據(jù)吸光度測定所得的蛋白濃度，在實驗結(jié)束后置于-80℃的冰箱中保存。

1.3.2制備組織蛋白，水解多肽混合物 將樣本于-80℃的冰箱中取出，放至室溫后，將組織蛋白用碳酸氫銨稀釋液稀釋提取，目的是為了使尿素濃度低于2 mol/L。加入DTT充分混勻后，使其最終濃度為20 mmol/L，然后使反應(yīng)物平衡至室溫，室溫時再加入IAM，充分混勻后，調(diào)定為50 mmol/L的終濃度，避光使其反應(yīng)30 min。加入胰酶，使蛋白和胰酶按照50∶1的比例，將其置于37℃水浴箱孵育過夜，將酶切產(chǎn)物存于-80℃的冰箱中。

1.3.3液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析分離鑒定多肽混合物用0.1%甲酸使上述樣品溶解，每次取50 μg樣品，為了進(jìn)行洗脫分離，使樣品首先通過串聯(lián)的強(qiáng)陽離子柱，繼而通過C18反相柱。用LT_QXL質(zhì)譜儀以數(shù)據(jù)依賴的方式將得到的多肽進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析掃描。經(jīng)上述操作可得到相應(yīng)圖譜(MS/MS)，在Bioworks 3.3.1 SP1上整合圖譜，應(yīng)用其中的蛋白分析軟件(SEQUEST)來檢索數(shù)據(jù)庫，對蛋白及多肽進(jìn)行鑒定及差異比較。

1.3.4免疫印跡試驗將serPinA1作為目標(biāo)蛋白，用Western blot進(jìn)行試驗，以進(jìn)一步驗證在腎癌組織中serPinA1的高表達(dá)。于安捷倫科技公司購買serPinA1單克隆抗體，β-Actin為內(nèi)參抗體。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SEQUEST的方法，利用SPSS13.0對將二維液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用所得數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗分析，用t檢驗分析對液質(zhì)聯(lián)用所得圖譜進(jìn)行分析，當(dāng)P<0.05時，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，即有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1腎癌組織及癌旁健康組織蛋白酶解混合產(chǎn)物的液質(zhì)聯(lián)用分析腎癌組織及癌旁健康組織酶解后，應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用分析，對所得到的多肽質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行采集、分析及整理，其中腫瘤組織酶解混合物共鑒定了3440個多肽序列，癌旁健康組織共鑒定了1321個多肽序列，腫瘤組織得出882個蛋白質(zhì)鑒定資料，癌旁組織得到321個蛋白質(zhì)鑒定資料。

2.2將質(zhì)譜分析應(yīng)用于腎癌組織與癌旁健康組織差異蛋白質(zhì)本實驗中，用譜圖數(shù)在兩組樣品中同一個蛋白質(zhì)的豐度進(jìn)行評價。對于蛋白質(zhì)豐度的變化，需要滿足兩個條件，即兩個樣品中蛋白譜圖數(shù)的比值應(yīng)≥1；兩個樣品中蛋白譜圖數(shù)的差值要≥72。每種樣品均行三次實驗以避免誤差，而后進(jìn)行綜合分析。實驗中共得到41個差異蛋白，其中36個為上調(diào)蛋白，其余為下調(diào)表達(dá)。可見本實驗中serPinA1蛋白是明顯上調(diào)的，其質(zhì)譜結(jié)果見圖1。

圖1 腎癌組織與癌旁健康組織差異蛋白質(zhì)質(zhì)譜結(jié)果

2.3SerPinA1蛋白免疫印跡結(jié)果應(yīng)用Western blot法對serPinA1蛋白在腎癌組織與癌旁組織的表達(dá)情況進(jìn)行驗證。根據(jù)絲氨酸蛋白酶抑制劑A1的表達(dá)情況，將絲氨酸蛋白酶抑制劑A1在癌組織與癌旁組織中的表達(dá)進(jìn)行比較，其明顯高表達(dá)于癌組織?？梢妶D2。這個使serPinA1蛋白在腎癌組織中是高表達(dá)，在癌旁組織中是低表達(dá)得到了進(jìn)一步的證實。

A:癌旁組織;B:癌組織

3 討論

腎癌起病隱匿，一般患者出現(xiàn)癥狀前來就診時已處于中晚期，行手術(shù)、放化療及透析治療等治療方式，不僅給患者帶來了極大的痛苦，且預(yù)后較差，生存率較低。因此，尋找一種或幾種敏感敏感指標(biāo)以早期確診腎癌至關(guān)重要。為了盡早的發(fā)現(xiàn)靈敏度高、特異度好的腫瘤標(biāo)志物，可選擇利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，可以使腫瘤被早期診斷，進(jìn)而早期治療，也能改善患者的預(yù)后，這是具有非常重要的意義的，同時也能給患者和家屬帶來非常大的幫助，給他們帶來希望。

有研究表明，在多種癌癥中serPinA1蛋白均呈先高表達(dá)的狀態(tài)，如：lung cancer、breast cancer、ovarian cancer、liver cancer、gastric cancer等[4]。國外學(xué)者研究表明，serPinA1在4級神經(jīng)膠質(zhì)瘤中明顯高表達(dá)于3級神經(jīng)膠質(zhì)瘤，而且高表達(dá)的serPinA1標(biāo)明預(yù)后差[5]。馬瑛[6]等人的研究還表明絲氨酸蛋白酶抑制劑在卵巢癌的發(fā)展過程中可能仍發(fā)揮著腫瘤抑制基因的作用。絲氨酸蛋白酶抑制劑可能通過從蛋白質(zhì)和mRNA水平下調(diào)的卵巢癌中VEGF的表達(dá)這一機(jī)制抑制卵巢癌血管生成。Shakya R[7]等人的研究表明，絲氨酸蛋白酶抑制劑的亞型alpha-1在肺癌的診斷中有著重要的價值。它可以協(xié)同TP53，大大增加了TP53的表達(dá)，對肺癌的診治有著十分重要的意義。馮希伯-林道氏病(VHLD)是一種罕見的遺傳性腫瘤綜合征。在所有與VHLD相關(guān)的腫瘤中，透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌(ccRCC)是導(dǎo)致死亡的主要原因。在Mandili G等

人的試驗中，比較了VHLD患者、ccRCC患者和健康志愿者的尿蛋白組，結(jié)果表明在所有不同表達(dá)的蛋白質(zhì)中，alpha-1抗胰蛋白酶(A1AT)在具有ccRCC歷史的VHLD患者的尿液中是非常豐富的。故A1AT可能是一種非侵入性生物標(biāo)記物，它在VHLD的診治中有一定的輔助診斷意義[8]。

以上這些研究說明絲氨酸蛋白酶抑制劑A1參與了多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本實驗采用液質(zhì)聯(lián)用及Western blotting分驗證了serPinA1在腎癌組織及癌旁健康組織的表達(dá)情況：即表達(dá)的蛋白量在腎癌組織中明顯高于癌旁健康組織。因此，檢測絲氨酸蛋白酶抑制劑A1在腎癌組織中的表達(dá)水平可以作為一種早期篩查癌變的輔助標(biāo)志物，為腎癌的早期診斷及治療提供了新的方向。但是仍需進(jìn)一步完善serPinA1在腫瘤進(jìn)展中的機(jī)制，以便更好的為臨床服務(wù)。