李海云，姚拓*，張榕，張潔，李智燕，榮良燕，路曉雯，楊曉蕾，夏東慧，羅慧琴

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省草原技術(shù)推廣總站，甘肅 蘭州 730010)

植物根際促生菌在土壤肥力形成、營養(yǎng)循環(huán)、植物生長等方面發(fā)揮著重要作用[1]。促生菌的促生作用[主要有固氮、分泌吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)、溶磷和生防效果等]主要體現(xiàn)在改善植物根際營養(yǎng)環(huán)境，分泌促生物質(zhì)以及提高寄主對非生物脅迫的忍耐力等方面[2-3]。利用從不同植物根際分離、篩選的優(yōu)良促生菌資源研制的微生物菌肥，與化肥、農(nóng)藥相比，微生物菌肥具有成本低、增產(chǎn)穩(wěn)定、非再生能源消耗少，對生態(tài)環(huán)境友好、農(nóng)產(chǎn)品安全，經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)點(diǎn)[4]。因此，植物根際促生菌種資源的篩選成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。目前，針對玉米(Zeamays)[5]、水稻(Oryzasativa)[6]、小麥(Triticumaestivum)[7-8]等作物根際促生菌資源的篩選研究較多，而對于牧草相關(guān)研究卻鮮有報(bào)道。岷山紅三葉(Trifoliumpratense)是一種藥草兼用型優(yōu)質(zhì)豆科牧草，其粗蛋白和異黃酮含量是玉米和大豆(Glycinemax)的2.3和10.0倍，是異黃酮提取的優(yōu)質(zhì)原料[9]。近年來，為追求經(jīng)濟(jì)效益，種植者將大量工業(yè)磷肥和農(nóng)藥施用于岷山紅三葉，這一措施雖取得了一定的成效，但存在很多問題[10]，如增加岷山紅三葉的種植成本，土壤肥力下降，天然草場土壤微生物區(qū)系多樣性破壞以及環(huán)境污染等[11]。而植物根際溶磷菌可以把土壤中不能被植物利用的無機(jī)磷轉(zhuǎn)化為植物可利用的有機(jī)磷，促進(jìn)植物磷素的供應(yīng)和生長[12]。因此，從岷山紅三葉根際土壤中篩選出具有溶磷、生防能力的菌株，將其制成微生物磷肥，以實(shí)現(xiàn)部分替代工業(yè)磷肥的目標(biāo)具有重要意義。目前溶磷菌株通常采用Pikovaskaia’s(PKO)培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，根據(jù)溶磷菌在PKO培養(yǎng)基上形成的溶磷圈初步判斷菌株的溶磷能力[13]。但是有些溶磷菌在該培養(yǎng)基上形成的溶磷圈很小，但其溶解無機(jī)磷酸鹽的能力卻較強(qiáng)。為解決這一問題，Gupta等[14]在PKO培養(yǎng)基中加入了溴苯酚，以提高溶磷圈的清晰度和透明度，卻并沒有有效解決這一問題。林啟美等[15]，齊文娟等[16]研究發(fā)現(xiàn)，該培養(yǎng)基中Fe、Mn、Na等金屬離子的存在對溶磷菌溶磷能力的發(fā)揮具有一定的限制作用。因此，本研究采用PKO、PKOC1和PKOC2溶磷培養(yǎng)基對岷山紅三葉根際溶磷菌進(jìn)行篩選和優(yōu)良溶磷菌株鑒定，并對分離篩選效果較好的PKOC2培養(yǎng)基進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，為岷山紅三葉根際促生菌特性研究及制備生物菌肥提供基礎(chǔ)資料和菌種資源支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1采樣地概況及樣品采集 采樣地位于甘肅省定西市岷縣岷山紅三葉培育基地，地理位置為北緯34°07′34″-34°45′00″，東經(jīng)103°41′29″-104°59′23″，屬于典型的高寒陰濕區(qū)，適宜岷山紅三葉生長，是我國岷山紅三葉的主要培育區(qū)和種植區(qū)。海拔2493 m，年均降水量約為700 mm，無霜期112 d，年均氣溫5.8 ℃，年均日照2228.6 h。試驗(yàn)區(qū)土壤為亞高山草甸土，土壤pH為7.4～7.8，有機(jī)質(zhì)含量11.8 g·kg-1，有效氮95.05 mg·kg-1，有效磷7.32 mg·kg-1，有效鉀182.8 mg·kg-1。2013年5和7月采集岷山紅三葉的根系及根際土壤，裝入無菌樣品采集袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌株分離。

1.1.2培養(yǎng)基 采用Pikovaskaia’s(PKO)、PKOC1[17]和PKOC2[17]3種溶磷培養(yǎng)基，對紅三葉根際土壤溶磷菌株進(jìn)行初篩；LB培養(yǎng)基用于菌株的活化與保存。1)PKO培養(yǎng)基配方為：蔗糖 10 g，Ca3(PO4)25 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.2 g，KCl 0.2 g，MgSO40.1 g，MnSO40.002 g，F(xiàn)eSO40.002 g，酵母膏 0.5 g，瓊脂 18 g，補(bǔ)加蒸餾水至1.0 L，調(diào)節(jié)pH至6.8～7.0；2)PKOC1培養(yǎng)基配方為：葡萄糖 10 g，Ca3(PO4)25 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，KCl 0.2 g，MnSO40.002 g，F(xiàn)eSO40.002 g，瓊脂 18 g，補(bǔ)加蒸餾水至1.0 L，調(diào)節(jié)pH至6.8～7.0；3)PKOC2培養(yǎng)基配方為：葡萄糖 10 g，Ca3(PO4)25 g，MgCl2·6H2O 5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KCl 0.2 g，(NH4)2SO40.1 g，瓊脂 18 g，補(bǔ)加蒸餾水至1.0 L，調(diào)節(jié)pH至6.8～7.0；4)LB培養(yǎng)基：酵母膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 10 g，瓊脂 18 g，補(bǔ)加蒸餾水至1.0 L，調(diào)節(jié)pH至7.0。

1.2 溶磷菌篩選

準(zhǔn)確稱取10 g紅三葉根際土壤樣品裝入250 mL三角瓶中，加入90 mL無菌水及玻璃珠，在室溫條件下200 r·min-1振蕩30 min。采用稀釋法將菌懸液涂布于PKO、PKOC1和PKOC2培養(yǎng)基，各3次重復(fù)，在28 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，觀察平板上菌落生長及菌落周圍透明圈變化情況，挑取培養(yǎng)基上形成的透明圈較為明顯的單個(gè)菌落，進(jìn)一步通過劃線進(jìn)行純化。將各菌株重新接種到PKO培養(yǎng)基上，各3次重復(fù)。28 ℃條件下培養(yǎng)13 d，分別在第5、7、9、11、13天觀察并記錄透明圈的大小，并計(jì)算D/d值[D為溶磷圈直徑(cm)，d為菌落直徑(cm)]，根據(jù)D/d值初步判斷各菌株的溶磷能力，并將菌株接種于LB斜面培養(yǎng)基上，保存于4 ℃冰箱中備用。

1.3 優(yōu)良溶磷菌株鑒定

將保存的優(yōu)良溶磷菌株在LB平板上進(jìn)行活化，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)對菌株基因組DNA進(jìn)行提取。采用細(xì)菌16S rRNA基因特異性引物27 F和1492 R[14]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系為50 μL：DNA模板2 μL，2×Taq PCR預(yù)混酶 25 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 21 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃總延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序。所測基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性序列比對，并采用MEGA 5.0軟件中的鄰近法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值為1000次。

1.4 溶磷培養(yǎng)基優(yōu)化

1.4.1最佳影響因子選擇 在150 mL三角瓶中，分別配制PKOC2培養(yǎng)基成分MgCl2添加量(2.5，5.0，10.0 g)，葡萄糖添加量(5，10，20 g)和(NH4)2SO4添加量(0.10，0.25，0.50 g)的培養(yǎng)基50 mL，以及采用不同碳源(果糖、半乳糖、甘露醇、木糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和蜜三糖)代替葡萄糖的培養(yǎng)基50 mL，各處理3次重復(fù)。在121 ℃滅菌20 min，在培養(yǎng)液中接種供試菌株MHS30菌懸液，28 ℃培養(yǎng)13 d后，將培養(yǎng)液8500 r·min-1，4 ℃離心10 min，取上清液，采用鉬銻抗比色法測定菌液中有效磷增量(扣除對照組的有效磷增量)[17]。

1.4.2響應(yīng)面優(yōu)化 根據(jù)確定的PKOC2培養(yǎng)基成分中主要影響因子的濃度范圍，以供試菌株的相對溶磷率為響應(yīng)值，采用Design-expert 8.0.6軟件中的Central composite design(CCD)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法和響應(yīng)面分析對PKOC2培養(yǎng)基成分的重要影響因子進(jìn)行優(yōu)化，因素水平設(shè)計(jì)見表1。試驗(yàn)結(jié)果利用Design-expert 8.0.6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用各因子兩兩交互響應(yīng)面、等高線以及響應(yīng)面回歸模型進(jìn)行優(yōu)化，找出供試菌株的最大溶磷量對應(yīng)各因子的最優(yōu)值，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

表1 中心組合試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of central composite design

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和多重比較分析，軟件Design-expert 8.0進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化及回歸方程方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶磷菌株初篩結(jié)果

利用3種不同溶磷培養(yǎng)基篩選岷山紅三葉根際溶磷菌，從紅三葉根際分離篩選出26株具有溶磷能力的菌株，部分平板初篩結(jié)果見表2。培養(yǎng)至第13天時(shí)，以D/d>2為衡量標(biāo)準(zhǔn)，PKO、PKOC1和PKOC2培養(yǎng)基分別可以獲得溶磷能力較好菌株2、4和6株?？梢姴捎肞KOC1和PKOC2培養(yǎng)基的效果要優(yōu)于PKO培養(yǎng)基，這兩種培養(yǎng)基可以從岷山紅三葉根際分離獲得更多的高效溶磷菌株。此外，利用3種培養(yǎng)基分離篩選岷山紅三葉根際溶磷菌，不但工作量大，而且菌株鑒定比較困難。因此有必要對上述培養(yǎng)基的組分加以優(yōu)化，本研究下一步選擇對分離篩選岷山紅三葉根際溶磷菌效果較好的PKOC2培養(yǎng)基進(jìn)行成分優(yōu)化。

2.2 優(yōu)良溶磷菌株鑒定

對分離自紅三葉根際土壤中的7株優(yōu)良溶磷菌株進(jìn)行16S rRNA基因序列鑒定，通過與現(xiàn)已報(bào)道的16S rRNA基因序列進(jìn)行相似性比對分析。根據(jù)16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析鑒定結(jié)果表明(圖1)：菌株MHS4為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)；菌株MHS7和MHS19為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)；菌株MHS27為蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)；菌株MHS30為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)；菌株MHS31為蓋氏假單胞菌(Pseudomonasgessardii)；菌株MHS49為產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)。

表2 部分溶磷菌平板初篩結(jié)果Table 2 The primary screening results of phosphate-solubilizing strains

注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: Values followed by different lowercase letters within the same column indicate significant differences atP<0.05 level among treatments, the same below.

2.3 最佳因子選擇

表3結(jié)果表明，采用果糖、半乳糖、甘露醇、木糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、蜜三糖等碳源代替葡萄糖時(shí)，培養(yǎng)基的溶磷量均低于碳源葡萄糖。當(dāng)葡萄糖濃度為20 g·L-1時(shí)，隨著MgCl2濃度的增加(2.5～10 g·L-1)，培養(yǎng)基的相對溶磷率呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(118.0%→122.5%→71.7%)；當(dāng)MgCl2濃度為10.0 g·L-1時(shí)，隨著葡萄糖濃度的增加(5～20 g·L-1)，培養(yǎng)基的相對溶磷率呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(73.2%→105.6%→71.7%)；當(dāng)MgCl2濃度為2.5 g·L-1時(shí)，隨著葡萄糖濃度的增加(5～20 g·L-1)，培養(yǎng)基的溶磷率一直呈現(xiàn)增大的趨勢(55.6%→92.6%→118.0%)；當(dāng)葡萄糖濃度為10 g·L-1時(shí)，隨著(NH4)2SO4濃度的增加(0.1～5.0 g·L-1)，培養(yǎng)基的相對溶磷率呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(86.6%→107.5%→102.1%)。由此可知，葡萄糖、MgCl2和硫酸銨添加量對PKOC2培養(yǎng)基的溶磷能力具有顯著影響，是該培養(yǎng)基成分的主要影響因子。

2.4 CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析

2.4.1CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以供試菌株MHS30溶磷量(P-solubilization capacity)為響應(yīng)值(Y)，通過CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出葡萄糖、MgCl2和(NH4)2SO4三個(gè)影響因子的最佳添加量(表4)。由表5分析結(jié)果表明：該模型極顯著(P<0.01)，說明回歸模型可用。方差分析失擬項(xiàng)為0.7319>0.05，說明所得的回歸方程與實(shí)際擬合中非正常誤差所占的比例較小。另外，確定系數(shù)R-Sq與Adj.R-squared分別為95.74%和91.91%，二者差距較小。從預(yù)測結(jié)果的整體估計(jì)來看，R-Sq和Pred.R-squared分別為95.74%和84.48%，說明該模型擬合度較好。同時(shí)，變異系數(shù)為2.72，說明試驗(yàn)可信度較高。得到的回歸方程為：Y=273.62+6.75A+5.58B+4.28C-1.82AB-11.04AC+12.88BC-9.63A2-9.92B2-12.22C2。該回歸模型中的一次項(xiàng)A(葡萄糖)、B(MgCl2)對菌株的溶磷能力有極顯著影響(P<0.01)，C[NH4)2SO4]對菌株的溶磷能力有顯著影響(P<0.05)，并且影響的程度從大到小依次為：A(葡萄糖)>B(MgCl2)>C[(NH4)2SO4]。此外，二次項(xiàng)A2、B2和C2也會(huì)對溶磷能力產(chǎn)生顯著影響(P<0.01)。上述結(jié)果表明，該模型為溶磷培養(yǎng)基的篩選提供了可靠的模型，可利用Design-expert軟件優(yōu)化回歸方程，預(yù)測3個(gè)因素的最優(yōu)參數(shù)。

圖1 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的菌株與相近種之間的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences showing the relationships among representative strains and their closely related type strains

培養(yǎng)基組成Medium component相對溶磷率P-solubilization rate培養(yǎng)基組成Medium component相對溶磷率P-solubilization rate對照Contrast (PKOC2)100.0±0.3ePKOC2 (果糖Fructose, 5 g)40.1±0.8kPKOC158.9±0.4iPKOC2 (半乳糖Galactose, 5 g)45.9±0.6jPKO49.1±0.3jPKOC2 (甘露醇Mannitol, 5 g)28.7±0.6mPKOC2 (葡萄糖Glucose 5 g;MgCl2 2.5 g)55.6±0.3ijPKOC2 (木糖Xylose, 5 g)89.2±0.7gPKOC2 (葡萄糖Glucose 5 g;MgCl2 5.0 g)57.3±0.5iPKOC2 (蔗糖Sucrose, 5 g)41.5±0.3kPKOC2 (葡萄糖Glucose 5 g;MgCl2 10.0 g)73.2±0.6hPKOC2 (麥芽糖maltose, 5 g)32.4±0.5lPKOC2 (葡萄糖Glucose 10 g,MgCl2 2.5 g)92.6±0.5fPKOC2 (乳糖Lactose, 5 g)73.0±0.5hPKOC2 (葡萄糖Glucose 10 g,MgCl2 10.0 g)105.6±0.5dPKOC2 (蜜三糖Raffinose, 5 g)27.8±0.4mPKOC2 (葡萄糖Glucose 20 g,MgCl2 2.5 g)118.0±0.7bPKOC2 [(NH4)2SO4 0.1 g]86.6±0.4gPKOC2 (葡萄糖Glucose 20 g,MgCl2 5.0 g)122.5±1.1aPKOC2 [(NH4)2SO4 2.5 g]107.5±0.6cPKOC2 (葡萄糖Glucose 20 g,MgCl2 10.0 g)71.7±0.4hPKOC2 [(NH4)2SO4 5.0 g]102.1±0.1c

2.4.2響應(yīng)面分析 由圖2可以發(fā)現(xiàn)，葡萄糖與氯化鎂濃度兩因素之間的交互作用不顯著(P>0.05)；葡萄糖與硫酸銨濃度的交互作用極顯著(P<0.01)；氯化鎂與硫酸銨濃度之間的交互作用也極顯著(P<0.01)，響應(yīng)曲面和等高線的分析結(jié)果與方差分析所得的結(jié)果一致。PKOC2培養(yǎng)基最佳組分的預(yù)測由Design-expert通過求回歸方程最大值，當(dāng)最大響應(yīng)值Y(溶磷量)為276.77 μg·mL-1時(shí)，對應(yīng)的自變量A(葡萄糖)、B(MgCl2)和C[NH4)2SO4]分別為18.19、3.21和0.08 g·L-1。

表4 CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Design and results of central composite design

表5 回歸方程方差分析Table 5 Analysis of variance of regression equation

注：**,差異極顯著，P<0.01；*,差異顯著，P<0.05；ns,差異不顯著，P>0.05。

Note: **, difference is very significant,P<0.01; *, significant difference,P<0.05; ns, difference is not significant,P>0.05.

圖2 兩因素交互作用對菌株溶磷量影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots for the effects of cross-interactions among factors on phosphate solubilization capacity of the strain

2.4.3驗(yàn)證試驗(yàn) 為驗(yàn)證響應(yīng)面預(yù)測模型的可用性和驗(yàn)證回歸方程預(yù)測的可靠性，利用預(yù)測所得的最佳培養(yǎng)基組成進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，所測溶磷量為279.5 μg·mL-1，與預(yù)測值相近，因此該模型具有較好的可信度，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

3 討論與結(jié)論

高效溶磷菌可以有效轉(zhuǎn)化土壤中不易被植物直接吸收利用的無機(jī)磷[4]，提高土壤難溶磷的有效性和磷肥的利用效率，對促進(jìn)植物生長具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)同一株溶磷菌在不同的溶磷培養(yǎng)基上其溶磷能力差異較大，就菌株MHS30而言，在PKO、PKOC1和PKOC2培養(yǎng)基上D/d值分別為1.44、1.95和2.90，究其原因主要與培養(yǎng)基的組成及添加量有關(guān)，故溶磷培養(yǎng)基的優(yōu)化對篩選出高效溶磷菌株顯得尤為重要。溶磷微生物正常的生長繁殖，不僅需要充足的碳源物質(zhì)，而且還需要氮、磷、鉀、鈣、鎂、鐵等無機(jī)鹽成分，有些微生物還需要特殊的生長因子[18]。對于溶磷培養(yǎng)條件的優(yōu)化也早有研究，大多從C源、N源、NaCl、pH、裝液量、接種量、種齡、溫度、搖床轉(zhuǎn)速等方面來進(jìn)行研究[19-22]。溶磷過程是復(fù)雜的，并不是某一因素起全部作用，而是多種因素共同作用的結(jié)果，溶磷培養(yǎng)條件也會(huì)因菌株的不同而異。溶磷微生物溶磷能力的大小常通過采用PKO固體培養(yǎng)基定性測定和PKO液體培養(yǎng)基定量測定[13]。用溶磷圈法定性判定菌株是否具有溶磷能力存在一定的局限性，這有可能是因?yàn)椴煌袡C(jī)酸擴(kuò)散機(jī)理不同。相對于溶磷圈法定性判定溶磷菌的溶磷能力，液體培養(yǎng)定量測定方法更為合理和科學(xué)[19,22]。然而另有研究證明PKO培養(yǎng)基中的酵母粉對溶磷菌溶解無機(jī)磷有限制作用，而MgCl2對溶磷菌溶磷非常重要[23]。同時(shí)有研究表明，去掉PKO培養(yǎng)基中的鐵、鎂、錳、鈉等無機(jī)鹽可顯著提高溶磷菌的溶磷能力[15]。有研究表明，溶磷菌對無機(jī)營養(yǎng)需要量很少，磷礦粉中的含量能夠滿足其需要，去掉培養(yǎng)基中鐵、錳、鎂、鈉等無機(jī)鹽能顯著提高細(xì)菌溶解磷礦粉的能力，并且培養(yǎng)基中缺少這些離子，能減少磷酸根與其反應(yīng)形成難溶性化合物，從而避免了微生物釋放出來的磷被再固定[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖、氯化鎂、硫酸銨添加量對PKOC2培養(yǎng)基的溶磷能力具有顯著影響，是該培養(yǎng)基的關(guān)鍵影響因子。溶磷過程是復(fù)雜的，并不是某一因素起全部作用，而是多種因素共同作用的結(jié)果，因此確定培養(yǎng)基最佳影響因子的最佳添加量對溶磷培養(yǎng)基的改良具有重要意義。通常優(yōu)化培養(yǎng)基的方法主要有正交試驗(yàn)和均勻試驗(yàn)，這些試驗(yàn)設(shè)計(jì)次數(shù)較少，獲得的優(yōu)化結(jié)果不夠準(zhǔn)確，而響應(yīng)面法(RSM)可解決優(yōu)化溶磷培養(yǎng)基組分的問題。Gao等[24]利用RSM中的CCD試驗(yàn)完成了乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，并使其制作成本降低了11%。Lotfy等[25]使用Box-Benhnken(Box)試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了黑曲霉的培養(yǎng)基組成，優(yōu)化后的培養(yǎng)基使菌株的檸檬酸產(chǎn)率提高了14倍以上。本研究對溶磷PKOC2培養(yǎng)基的組成采用響應(yīng)曲面法進(jìn)行優(yōu)化，最佳培養(yǎng)基成分為(1.0 L)：葡萄糖18.19 g，Ca3(PO4)25 g，MgCl2·6H2O 3.21 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KCl 0.2 g，(NH4)2SO40.08 g。從研究結(jié)果還可以發(fā)現(xiàn)，溶磷圈可以作為篩選溶磷菌株的必要條件，但不是充分條件，僅僅靠溶磷圈的大小來判斷溶磷菌株溶磷能力的大小不夠完善[26]。齊文娟等[16]研究發(fā)現(xiàn)，不添加酵母膏的PKO培養(yǎng)基更適用于分離篩選小麥和苜蓿根際的溶磷細(xì)菌，并且該培養(yǎng)基被改良之后，4種溶磷細(xì)菌分泌出的有機(jī)酸種類和含量都有明顯的增加。定量分析雖然可靠，但是對于大量溶磷菌株的初篩來講，定性分析也是必不可少的，通過定性分析菌株是否產(chǎn)生溶磷圈可以縮短篩選溶磷菌株的時(shí)間。植物根際土壤中存在多種溶磷微生物，不同溶磷微生物的溶磷途徑復(fù)雜多樣。近年來的研究資料表明，分泌有機(jī)酸是溶磷微生物溶磷的主要途徑之一。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的溶磷微生物培養(yǎng)過程中分泌的有機(jī)酸種類主要有：乙酸、丙二酸、草酸、乳酸、丁酸、丙酸、葡萄糖酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸等[15,27]。這幾類有機(jī)酸分泌到土壤中會(huì)使土壤酸度增加，有效促進(jìn)土壤中難溶性磷酸鹽的轉(zhuǎn)化和吸收，進(jìn)而促進(jìn)作物生長。然而不同溶磷微生物分泌的有機(jī)酸種類和含量各不相同，其溶磷途徑也存在很大差異，因此有必要對上述分離篩選的溶磷菌株的溶磷機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究。