吳娟子，錢晨，劉智微，潘玉梅，鐘小仙*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇 南京 210014；2.國家牧草育種創(chuàng)新基地, 江蘇 南京 210014；3.農(nóng)業(yè)部種養(yǎng)結(jié)合重點實驗室，江蘇 南京 210014)

象草(Cenchruspurpureus)是多年生禾本科C4植物，是世界上生物量最高的草本植物，年生物量高達45000 kg·hm-2[1]，適于各種類型的土壤生長，特別具有在鹽堿地、重金屬及有機物等污染土壤中仍可生長良好的優(yōu)點，象草不僅是草食畜禽的優(yōu)質(zhì)青飼料、理想的水土保持作物、優(yōu)質(zhì)紙漿和綠色環(huán)保型復(fù)合人造板原料，還是理想的木質(zhì)纖維素類能源作物[1-5]。象草株高可達3～5 m，莖粗，莖/葉高。象草莖的特性對于其作為飼料或其他工業(yè)原料的質(zhì)量具有重要意義。提高象草莖細(xì)胞壁的纖維素含量，降低其木質(zhì)素含量，可以改善其飼料品質(zhì)和木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化利用效率；提高莖中的木質(zhì)素含量，有利于其作為板材的性能。象草是具有復(fù)雜遺傳多樣性的異源四倍體(2n=4x=28)，在利用基于表型選擇的傳統(tǒng)育種方法改善象草農(nóng)藝性狀方面已經(jīng)取得了一些進展，但是基因工程、分子育種等方法在該物種中還未見報道[6-7]。象草的全基因組還未破譯，遺傳信息十分匱乏。轉(zhuǎn)錄組和基因組信息的匱乏限制了象草莖的生物合成與調(diào)控的研究。

Illumlna RNA-Seq是第二代轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，具有高通量、低成本的特點，并且不需要相應(yīng)的測序參考基因組信息，對于許多缺乏基因組信息的物種而言，其具有明顯的優(yōu)勢[8]。目前，轉(zhuǎn)錄組測序在紫花苜蓿(Medicagosativa)[9]、白三葉(Trifoliumrepens)[10]、草地早熟禾(Poapratensis)[11]、羊草(Leymuschinensis)[12]等牧草研究中都有應(yīng)用。

本研究在前期系統(tǒng)評價90份象草資源的農(nóng)藝性狀和其中73份資源莖稈細(xì)胞壁組成的基礎(chǔ)上[13]，挑選了酸性木質(zhì)素含量最高的eg7和最低的eg87兩份材料，eg7和eg87的酸性木質(zhì)素含量分別為16.9%和5.7%，對其進行莖轉(zhuǎn)錄組測序和分析，以期為象草的分子生物學(xué)研究提供寶貴的基因組數(shù)據(jù)，并為進一步挖掘象草木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2014年5月4日，從江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家牧草育種創(chuàng)新基地大棚內(nèi)取越冬保存的象草eg7和eg87根莖，分株移栽于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大田，供試土壤屬粘性馬肝土，肥力中等，整個試驗地肥力均勻。8月6日，選取生長94 d后、健康的莖桿中部的莖段組織(從基部起第7和第8個莖節(jié)之間的莖段組織)，迅速將其放入錫箔紙內(nèi)，立即經(jīng)液氮速凍后保存于-80 ℃?zhèn)溆?。每個材料選取3個健康單株，用于總RNA提取，等量混合株系內(nèi)的RNA樣品。

1.2 象草莖細(xì)胞壁組分分析

10月18日，收獲象草整株莖稈，剪成10～15 cm莖段，105 ℃殺青30 min，70 ℃烘干至恒重。烘干的莖粉碎，過80目(0.18 mm)篩，冷卻后于密封袋中保存，待進一步分析。采用范氏洗滌纖維法測定纖維素(cellulose, CEL)、半纖維素(hemicelluloses, HMC)和酸性木質(zhì)素(acid detergent lignin, ADL)含量[14-15]。

1.3 RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序

象草莖段樣品送華大基因公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。利用TRIzol法提取莖段總RNA，RNA純化后利用NanoDrop和Agilent 2100檢測RNA質(zhì)量，質(zhì)量合格后建立測序文庫并利用Illumina HiSeq2000平臺測序。

1.4 數(shù)據(jù)組裝

獲得原始測序數(shù)據(jù)后，去除接頭序列、低質(zhì)量序列和N(不確定堿基)比例大于0.01%的序列，將過濾后的clean data利用SOAPdenovo軟件進行序列拼接，clean read拼接成重疊群(Contig)后進一步組裝成unigene[16]。

1.5 基因功能注釋

利用Blastx和Blastn程序?qū)⒔M裝獲得的象草unigene與蛋白質(zhì)、核酸數(shù)據(jù)庫進行比對(e-value<0.00001)，這些數(shù)據(jù)庫包括非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(non-redundant protein database, Nr)、蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(swissprot protein sequence database, Swiss-Prot)、東京基因與基金組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)和蛋白質(zhì)直系同源數(shù)據(jù)庫(cluster of orthologous groups, COG)、非冗余核酸序列數(shù)據(jù)庫(non-redundant nucleotide database, Nt)[17-20]。選取最佳的比對結(jié)果用于基因的功能注釋并確定基因的方向。

1.6 差異表達基因鑒定、分類及代謝途徑分析

以eg87為對照、eg7為處理組對所有unigene進行差異表達分析，找出在兩樣本間表達量不同的基因。為了確定兩個文庫之間差異表達的基因，使用RPKM(每百萬reads中來自于某基因每千堿基長度的reads數(shù), reads per kilobases per million mapped reads)方法分析所有組裝的unigene的轉(zhuǎn)錄豐度，RPKM方法消除了不同基因長度和測序水平對基因表達計算的影響[21]。用錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)(FDR≤0.001)和兩個樣本的RPKM比值(|log2 Ratio|≥1)作為差異基因的篩選條件。根據(jù)比對Nr數(shù)據(jù)庫獲得的信息，使用Blast2GO軟件[16]得到差異表達的unigene的基因本體論 (gene ontology, GO)條目，然后用WEGO軟件對這些基因進行GO功能分類統(tǒng)計，同時利用KEGG數(shù)據(jù)庫比對進行功能分類和代謝途徑分析。

1.7 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的qRT-PCR驗證

分別提取、純化eg7和eg87兩個材料莖段的RNA，采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas)合成cDNA第一鏈。選取9條木質(zhì)素單體合成候選unigene，象草elongation factor 1a (CpEF1a)和actin (CpActin)作為內(nèi)參基因，設(shè)計qRT-PCR引物，引物序列見表1。利用LightCyclerR480 fluorescence real time PCR machine (Roche)完成熒光定量PCR實驗，PCR程序為：95 ℃預(yù)變性10 min；40個循環(huán)(95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，80 ℃ 1 s收集熒光，讀板)；之后72 ℃延伸10 min，最后從65 ℃開始，以每步0.5 ℃的速度升高至95 ℃，每個溫度保持1 s，繪制溶解曲線。每個樣品3個生物學(xué)重復(fù)。

1.8 數(shù)據(jù)處理

用Excel軟件初步處理數(shù)據(jù)，采用SAS 8.2統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 象草莖細(xì)胞壁組分分析

選擇大田種植條件下的象草eg7和eg87進行莖細(xì)胞壁組分分析，結(jié)果顯示兩基因型間莖半纖維素含量無顯著差異(P>0.05)，eg7莖中纖維素和酸性洗滌木質(zhì)素含量比eg87中分別高20.3% (P<0.05)和186.5% (P<0.01)(表2)。

2.2 象草莖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)統(tǒng)計、組裝

采用Illumina Hiseq 2000高通量測序技術(shù)對象草莖組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，共得到了169630902條原始片段，過濾去除低質(zhì)量片斷和接頭后獲得153204888條、共13788439920 nt的clean read，其Q20%為97.25%～98.48%(表3)。原始測序數(shù)據(jù)已提交到NCBI的序列片段歸檔(sequence read archive, SRA)數(shù)據(jù)庫(BioprojectID: PRJNA357342)。經(jīng)Trinity程序(http://trinityrnaseq.sourceforge.net/)對象草轉(zhuǎn)錄組clean read進行無參拼接后，共獲得317216 個contigs (eg7：148201；eg87：169015)，其中≥500 nt的contig序列有37155個(eg7：17259；eg87：19896)(表4)，在contig數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，進一步對序列進行組裝，共獲得87641個unigene序列，平均長度為580 nt，N50為780 nt，其中12863 unigene (14.68 %)序列長度大于1000 nt(表5)。

表1 象草差異表達基因qRT-PCR引物Table 1 Primers used for expression pattern validations of selected unigenes by qRT-PCR

2.3 基因功能注釋

為了預(yù)測象草unigene的功能，對unigene進行蛋白編碼序列(coding sequences，CDS)預(yù)測，比對到蛋白庫的CDS有56725個，理論的CDS有3532個，預(yù)測到CDS的unigene共60257個(68.75%)。將unigene核酸序列及預(yù)測的蛋白序列分別與NCBI Nr、NCBI Nt、Swiss-Prot、GO、COG和KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對，通過序列相似性對unigene進行功能注釋，最終87641條unigenes中有62557條(71.38%)獲得注釋，其中Nr和Nt數(shù)據(jù)庫注釋的信息最多，分別是64.35%和63.33%。統(tǒng)計結(jié)果見表6。

近緣物種相似序列匹配分析結(jié)果見圖1，與高粱(Sorghumbicolor)數(shù)據(jù)庫中序列相似的象草unigene最多，比例高達44.8%，其次為玉米(Zeamays, 29.8%)、粳稻(Oryzasativasubsp.Japonica, 9.2%)、短柄草(Brachypodiumdistachyon, 3.6%)、秈稻(Oryzasativasubsp.Indica, 2.6%)以及大麥(Hordeumvulgare, 1.7%)。

表2 象草基因型eg7和eg87莖細(xì)胞壁組分比較Table 2 Comparison of cell wall components in stems of genotypes 7 (eg7) and 87 (eg87) (%)

注：表中數(shù)據(jù)表示3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；對兩基因型間每一測量指標(biāo)的差異顯著性進行統(tǒng)計分析，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note: Comparison was made between eg7 and eg87, each variable was mean of three time repeated, datas are mean±SD. The different lowercases denoted that the difference was significant (P<0.05), and the different capitals denoted that the difference was extremely significant (P<0.01).

表3 測序數(shù)據(jù)輸出質(zhì)量情況Table 3 Summary of the sequencing reads for C. purpureus

表4 象草eg7和eg87轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)contig組裝統(tǒng)計Table 4 Contig statistics of Ilumina transcriptome assembly for C. purpureus

表5 象草eg7和eg87轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)unigene組裝統(tǒng)計Table 5 Unigene statistics of Ilumina transcriptome assembly for C. purpureus

2.4 差異表達基因分析

對eg87(對照)與eg7(處理)進行差異基因(differentially expressed genes, DEGs)篩選，經(jīng)篩選，共鑒定出33323個差異表達的基因，其中上調(diào)基因有9704個，占差異表達基因總數(shù)的29.12%；下調(diào)基因共23619個，占差異表達基因總數(shù)的70.88%，結(jié)果如圖2所示。

2.5 差異表達基因GO分析和KEGG pathway分析

GO分析是一種常用的基因功能分析方法，它按照生物途徑(biology process)，細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)3個大類將基因分別歸入一個個功能類群，并對基因進行注釋；代謝通路(pathway)分析則是將基因具體到代謝網(wǎng)絡(luò)和代謝通路的特定位置。GO分析和pathway分析有助于我們了解差異基因主要富集在哪些功能類群，導(dǎo)致哪些代謝通路發(fā)生顯著改變，這些信息對于機制研究顯得尤為重要。

表6 象草unigene在6個數(shù)據(jù)庫中的功能注釋情況Table 6 Summary of functional annotation of assembled unigenes from C. purpureus

圖1 Nr注釋的物種分布Fig.1 Annotation of species distribution from Nr database

對eg7與對照組eg87之間的差異表達基因進行GO功能分析發(fā)現(xiàn)：所有差異基因被歸為54個功能類別，統(tǒng)計每一功能類群差異基因數(shù)目，其中細(xì)胞過程(cellular process)、代謝過程(metabolic process)、細(xì)胞(cell)，細(xì)胞部分(cell part)、捆綁(binding)、催化活性(catalytic activity)等變化最為顯著(圖3)。

圖2 象草eg7和eg87差異表達基因Fig.2 The distribution of differentially expressed genes (DEGs)

圖3 象草eg7和eg87(CK)差異表達基因GO富集分類Fig.3 GO enrichment classification of differentially expressed genes 1：生物粘附Biological adhesion；2：生物調(diào)節(jié)Biological regulation；3：細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生Cellular component organization or biogenesis；4：細(xì)胞過程Cellular process；5：發(fā)育過程Developmental process；6：定位建成Establishment of localization；7：生長Growth；8：免疫系統(tǒng)過程Immune system process；9：定位Localization；10：運動Locomotion；11：代謝過程Metabolic process；12：多生物過程Multi-organism process；13：多細(xì)胞生物過程Multicellular organismal process；14：生物過程負(fù)調(diào)控Negative regulation of biological process；15：生物過程正調(diào)控Positive regulation of biological process；16：生物過程調(diào)節(jié)Regulation of biological process；17：繁殖Reproduction；18：繁殖過程Reproductive process；19：刺激響應(yīng)Response to stimulus；20：節(jié)律過程Rhythmic process；21：信號Signaling；22：單一生物過程Single-organism process；23：細(xì)胞Cell；24：細(xì)胞連接Cell junction；25：細(xì)胞部分Cell part；26：細(xì)胞外基質(zhì)Extracellular matrix；27：細(xì)胞外基質(zhì)部分Extracellular matrix part；28：細(xì)胞外區(qū)域Extracellular region；29：細(xì)胞外區(qū)域部分Extracellular region part；30：大分子復(fù)合物Macromolecular complex；31：膜Membrane；32：膜部分Membrane part；33：膜封閉的內(nèi)腔Membrane-enclosed lumen；34：類核Nucleoid；35：細(xì)胞器Organelle；36：細(xì)胞器部分Organelle part；37：共質(zhì)體Symplast;38：病毒Virion；39：病毒體部分Virion part；40：抗氧化活性Antioxidant activity；41：捆綁Binding；42：催化活性Catalytic activity；43：通道調(diào)節(jié)器活動Channel regulator activity；44：電子載體活性Electron carrier activity；45：酶調(diào)節(jié)劑活性Enzyme regulator activity；46：金屬伴侶活性Metallochaperone activity；47：分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性Molecular transducer activity；48：核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性Nucleic acid binding transcription factor activity；49：營養(yǎng)儲藏活動Nutrient reservoir activity；50：蛋白質(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性Protein binding transcription factor activity；51：受體活性Receptor activity；52：結(jié)構(gòu)分子活性Structural molecule activity；53：翻譯調(diào)節(jié)器活動Translation regulator activity；54：轉(zhuǎn)運蛋白活性Transporter activity.

將獲得的87641條unigene與KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對，共有33590(38.32%)條unigene獲得注釋，富集得到127條代謝通路。篩選出15條差異基因顯著富集的代謝通路，占差異基因總量的11.07%，富集程度最顯著的5個代謝通路是光合作用蛋白(photosynthesis-antenna proteins)、光合作用(photosynthesis)、betalain生物合成(betalain biosynthesis)、鞘糖脂生物合成-神經(jīng)節(jié)系列(glycosphingolipid biosynthesis-ganglio series)和苯丙烷類代謝途徑(phenylpropanoid biosynthesis)，主要涉及能量代謝、多聚糖合成代謝、次生代謝以及萜類和聚酮化合物代謝等。15條通路中，苯丙烷類代謝途徑相關(guān)的差異基因數(shù)目最多，達285條，占2.55%；其次為苯丙氨酸代謝(157條，1.40%)、二苯乙烯類和姜酚合成(133條，1.19%)、氰氨基酸代謝(108條，0.97%)和光合作用(98條，0.88%)，其他通路中差異基因占比相對較低(表7)。

苯丙烷類代謝途徑和與苯丙氨酸代謝途徑與細(xì)胞壁，尤其是木質(zhì)素合成密切相關(guān)。將苯丙烷類代謝通路中所有的差異表達基因(285條)全部挑出來，其中表達上調(diào)的有134條，表達下調(diào)的有151條。在苯丙烷類代謝途徑中共有83條unigenes注釋為木質(zhì)素單體合成酶基因，占整個苯丙烷類代謝通路差異基因的29.1%，其中表達上調(diào)的有64條，占該通路中上調(diào)表達差異基因的47.8%，其中RPKM比值上調(diào) 2、4、8、16、32、64 倍以上基因數(shù)目分別為25、18、6、6、1和8個；表達下調(diào)的有19條，占下調(diào)表達差異基因的12.6%。篩選出通路中unigene長度≥1000 nt、表達差異大于2倍的可能的木質(zhì)素單體合成酶基因，其中上調(diào)基因26條，有14個基因表達上調(diào)4倍以上，下調(diào)基因僅2條；我們選擇其中表達差異更顯著的CL927.Contig7(苯丙氨酸裂解酶, phenylalanine ammonialyase,PAL)、CL4041.Contig5(肉桂酸-4-羥基化酶, cinnamate 4-hydroxylase,C4H)、Unigene32577和CL11870.Contig2(4-香豆酸輔酶A連接酶, 4-coumarate CoA ligase4,CL)、CL2831.Contig3(羥基肉桂酰CoA轉(zhuǎn)移酶, hydroxycinnamoyl CoA transferase,HCT)、CL4302.Contig2(咖啡酰酸輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶, caffeoyl CoA O-methyltransferase,CCoAOMT)、CL1964.Contig1(肉桂酰CoA還原酶, cinnamoyl CoA reductase,CCR)、CL8338.Contig3(阿魏酸5-羥化酶, ferulate 5-hydroxylase,F5H)、CL6560.Contig1(肉桂醇脫氫酶, cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)作為木質(zhì)素單體合成酶候選基因待進一步分析。

表7 象草差異基因富集程度排名前15的代謝通路Table 7 Top 15 enrichment pathways in the stem of C. purpureus

表8 象草中差異表達的ClassⅢ型植物過氧化物酶基因Table 8 Expression of ClassⅢ peroxidase genes in the stem of C. purpureus

在285條苯丙烷類代謝差異基因中，101條unigenes注釋為ClassⅢ型植物過氧化物酶[peroxidase (EC:1.11.1.7)，CIII Prxs]，占整個苯丙烷類代謝通路差異基因的35.4%，其中表達上調(diào)的有22條，占該通路中上調(diào)表達差異基因的16.5%，其中RPKM比值上調(diào)2、4、8、16、32、64倍以上基因數(shù)目分別為7、7、2、2、2和2個；表達下調(diào)的有79條，占下調(diào)表達差異基因的52.3%，其中RPKM比值下調(diào)2，4，8、16、32、64倍以上基因數(shù)目分別為24、13、9、9、3和21個，且其中20條在eg7中表達量極低(raw reads為0)。我們篩選出通路中unigene長度≥1000 nt、表達差異大于2倍的CIII Prxs基因(表8)，其中下調(diào)基因14條，有6個基因表達下調(diào)8倍以上，上調(diào)基因3條，上調(diào)2～4倍；這些基因可能在苯丙烷類和木質(zhì)素代謝過程中發(fā)揮重要作用，我們選擇其中差異最為顯著的CL843.Contig2、CL438.Contig3、CL438.Contig4、Unigene22891、CL438.Contig5、CL11176.Contig2和CL467.Contig1作為CIIIPrxs候選基因待進一步分析。

圖4 差異表達基因的qRT-PCR驗證Fig.4 Validation of selected nine up-regulated transcripts in the eg7 as compared to the eg87 involved in lignin biosynthesis by qRT-PCR 圖中數(shù)據(jù)表示3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；對eg7和eg87間每一基因相對表達量的差異顯著性進行統(tǒng)計分析，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。Comparison was made between eg7 and eg87, each variable was mean of three time repeated, datas are mean±SD. The different lowercases denoted that the difference was significant (P<0.05), and the different capitals denoted that the difference was extremely significant (P<0.01).

2.6 差異表達基因qRT-PCR驗證

選取參與木質(zhì)素單體合成的9個差異表達基因，以Actin和EF1a為內(nèi)參進行qRT-PCR驗證。由圖4可知9個木質(zhì)素單體合成酶基因在eg7的表達量均顯著高于eg87，這與高通量測序結(jié)果表達趨勢一致。

3 討論

象草是地球上生物產(chǎn)量最高的禾本科、木質(zhì)纖維素類牧草，產(chǎn)量高、抗逆性強、用途廣泛，對于鹽堿、荒坡等邊際性土地的開發(fā)利用和重金屬、有機物污染土壤的修復(fù)利用具有重要應(yīng)用價值[1-5]。象草是一種復(fù)雜的異源四倍體，目前尚未完成基因組測序，沒有基因組序列可供參考，利用無參轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)挖掘象草關(guān)鍵功能基因具有重要意義。

細(xì)胞壁組分占象草干物質(zhì)重的80%，細(xì)胞壁的主要成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。纖維素和半纖維素是多糖，在酶的作用下可以轉(zhuǎn)化為可溶性糖供吸收利用，而木質(zhì)素能夠抵抗自然界多數(shù)微生物的有效降解[22]，大量研究表明木質(zhì)素是限制木質(zhì)纖維素類作物高效利用的關(guān)鍵因素之一[22-23]。

在象草eg7與eg87差異表達基因KEGG通路分析中，光合作用、betalain生物合成、鞘糖脂生物合成-神經(jīng)節(jié)系列和苯丙烷類代謝是差異基因富集程度最顯著的代謝通路，主要涉及能量代謝、多聚糖代謝和次生代謝；而其中參與木質(zhì)素合成的苯丙烷類代謝途徑具有最為豐富的差異表達基因。木質(zhì)素是一種復(fù)雜的酚類聚合物，木質(zhì)素單體合成是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，一般經(jīng)苯丙烷途徑進行合成[24]。木質(zhì)素單體合成酶基因主要包括：PAL、C4H、C3H、4CL、COMT、CCoAOMT、F5H、CAD和CCR，在玉米[25]、擬南芥[26]、楊樹(Populustremuloides)[27]、黑麥草(Loliumperenne)[28]、柳枝稷(Panicumvirgatum)[29]等多種植物中的研究均發(fā)現(xiàn)：調(diào)控這些木質(zhì)素單體合成酶基因的表達，均能改變木質(zhì)素的含量或組成。在象草莖轉(zhuǎn)錄中我們挖掘出83條差異表達的木質(zhì)素單體合成酶基因，其中64條unigene在木質(zhì)素含量較高的eg7象草中上調(diào)表達。對挑選出的9條木質(zhì)素單體合成酶基因進行qRT-PCR表達分析，其在兩個象草材料中的表達趨勢與高通量測序結(jié)果一致。

ClassⅢ型植物過氧化物酶[peroxidase (EC:1.11.1.7)，CIII Prxs]是植物特異性蛋白質(zhì)，以多基因家族存在于植物中，基因名為POX、PRX或PER[30]。CIII Prxs具有很多同工酶，功能多樣，如參與植物激素代謝、活性氧(reactive oxygen species, ROS)等信號分子代謝、植物抗病反應(yīng)以及細(xì)胞壁的松弛和硬化[31]。在植物生長期間，細(xì)胞的伸長與細(xì)胞壁的松弛和硬化(木質(zhì)化、蠟質(zhì)化等)緊密相關(guān)。這兩個過程之間的平衡可以通過CIII Prxs的拮抗活性精確控制。CIII Prxs能夠通過在H2O2存在下氧化芳香族細(xì)胞壁化合物而使細(xì)胞壁硬化，例如氧化木質(zhì)素單體形成木質(zhì)素聚合物[30]，或者通過調(diào)節(jié)局部H2O2濃度或產(chǎn)生活性氧(ROS)破壞細(xì)胞壁聚合物中的共價鍵而松弛細(xì)胞壁[32]，還能通過其生長素氧化酶活性控制細(xì)胞伸長[33]。因此，整個細(xì)胞伸長、細(xì)胞壁的松弛和硬化都可以由不同的CIII Prx亞型以及精細(xì)的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制所控制[30]。

前人已在玉米[34]、番茄(Lycopersiconesculentum)[35]、煙草(Nicotianatabacum)[36]、百日草(Zinniaelegans)[37]等多種植物和組織培養(yǎng)系統(tǒng)中證實CIII Prxs參與木質(zhì)素合成。De等[34]在玉米中分離出三種編碼不同CIII Prxs的cDNA，命名為ZmPox1，ZmPox2和ZmPox3，原位雜交表明ZmPox2 mRNA大量積累在幼根伸長區(qū)木質(zhì)化的維管組織和表皮中。過表達番茄過氧化物酶基因(TPX1)，轉(zhuǎn)基因植株中木質(zhì)素含量迅速增加[35]；反向抑制煙草NtPrx60基因的表達，煙草中木質(zhì)素含量顯著降低[36]。研究者在百日草懸浮細(xì)胞中成功純化和克隆了過氧化物酶(ZePrx)，研究表明ZePrx在百日草木質(zhì)部木質(zhì)化中發(fā)揮重要作用[37]。植物的木質(zhì)部分化受到嚴(yán)格的激素調(diào)節(jié)，啟動子分析表明ZePrx含有直接響應(yīng)生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素的順式元件，同時還含有響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子NAC，MYB，AP2，MADS和Class III HD Zip的靶序列[38-39]。在木質(zhì)部分化過程中，生長素和細(xì)胞分裂素通過上調(diào)這些轉(zhuǎn)錄因子而間接作用或直接作用于ZePrx，誘導(dǎo)ZePrx表達，這種效應(yīng)與生長素和細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)木質(zhì)部分化一致[38]。ZePrx直接受GA3調(diào)節(jié)，其活性被GA3抑制，這種效應(yīng)與GA抑制幼苗下胚軸細(xì)胞壁木質(zhì)化相一致[39]。Herrero等[40]利用擬南芥基因組進行生物信息學(xué)分析和數(shù)據(jù)挖掘，尋找擬南芥中與ZePrx功能相似的基因。研究者首先通過序列同源性分析，尋找到9個與ZePrx序列高度同源的序列(AtPrx4, 5, 52, 68, 67, 36, 14, 49和72)；通過分析其他參數(shù)，如表面電荷、翻譯后修飾、氨基酸的位置、穩(wěn)定性和壽命/半衰期后，進一步明確AtPrx4, 52, 49和72為過氧化物酶候選基因；通過對這4個AtPrx進行更深入的啟動子序列分析，發(fā)現(xiàn)AtPrx52還包含與ZePrx高度相似的順式調(diào)控元件，最終確定AtPrx52是最類似于ZePrx的過氧化物酶。后續(xù)的試驗證據(jù)表明AtPrx52確實與ZePrx功能相似，參與了木質(zhì)素合成。

8月取樣的象草正處于旺盛生長期，一方面大量莖干細(xì)胞細(xì)胞壁松弛，細(xì)胞伸長生長，一方面大量木質(zhì)素合成，細(xì)胞壁發(fā)生硬化，整個莖稈細(xì)胞處于細(xì)胞壁松弛和硬化的動態(tài)過程中。通過對木質(zhì)素含量差異顯著的象草eg7和eg87進行轉(zhuǎn)錄組比較分析，我們在差異基因高度富集的苯丙烷類代謝途徑中找到了101條差異表達的CIIIPrxs，占整個苯丙烷類代謝通路差異基因的35.4%，其中在木質(zhì)素含量較高的eg7中22條CIIIPrxs表達上調(diào)，79條CIIIPrxs表達下調(diào)，這表明CIIIPrxs在象草莖干生長、苯丙烷類和木質(zhì)素代謝過程中發(fā)揮重要而復(fù)雜的作用。我們選擇差異最為顯著的CL843.Contig2、CL438.Contig3、CL438.Contig4、Unigene22891、CL438.Contig5、CL11176.Contig2和CL467.Contig1作為CIIIPrxs候選基因，有待進一步開展深入的生物信息學(xué)分析和實驗分析以明確其真正的功能。

4 結(jié)論

本研究應(yīng)用第二代高通量測序技術(shù)對象草莖組織進行轉(zhuǎn)錄組比較測序，總獲得13788439920 nt數(shù)據(jù)，平均長度為580 nt的unigene 87641條，經(jīng)過蛋白質(zhì)編碼框預(yù)測、序列注釋和同源性分析，共62557條unigene獲得注釋，象草與高粱序列同源性最高。共鑒定出33323個差異表達基因，9704個上調(diào)表達，23619個下調(diào)表達。KEGG pathway分析顯示參與能量代謝、多聚糖代謝和次生代謝的光合作用代謝通路、betalain生物合成通路、苯丙烷類代謝通路差異基因富集程度最高；參與木質(zhì)素合成的苯丙烷類代謝通路具有最多的差異基因數(shù)目；PAL、C4H、C3H、4CL、COMT、CCoAOMT等木質(zhì)素單體合成酶基因和ClassⅢ peroxidase酶基因可作為候選基因，以期通過進一步的生物信息學(xué)分析和功能分析揭示調(diào)控象草木質(zhì)素合成的分子機制。